Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l'imagerie par résonance magnétique

Summary

Dans cette vidéo, nous montrons comment étiqueter cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec du chlorure de manganèse (MnCl₂), Qui peuvent pénétrer dans les cellules via les canaux calciques voltage-dépendants lorsque les cellules sont biologiquement actives. De plus, nous montrons l'utilisation de MnCl₂ Comme agent de contraste IRM cellulaire pour déterminer la viabilité in vitro des CSEh.

Abstract

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont démontré la capacité de restaurer les blessés du myocarde. Imagerie par résonance magnétique (IRM) a émergé comme l'une des modalités d'imagerie prédominante pour évaluer la restauration de la blessés myocarde. Par ailleurs, des agents de marquage ex vivo, tels que l'oxyde de fer nanoparticules, ont été employés pour suivre et localiser les cellules souches transplantées. Cependant, cette méthode ne permet pas de surveiller une propriété fondamentale de biologie cellulaire quant à la viabilité des cellules transplantées. Il est connu que le chlorure de manganèse _(MnCl2) pénètre dans les cellules via voltage-dépendants du calcium (Ca ^{2 +)} des canaux lorsque les cellules sont biologiquement actifs, et s'accumule intracellulairement pour générer l'effet T shortening ^1. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de CSEh dans le myocarde.

Dans cette vidéo, nous allons montrer comment étiqueter CSEh avec _MnCl2 et comment ces cellules peuvent être clairement vus en utilisant l'IRM in vitro. Dans le même temps, l'activité biologique de Ca ^{2 +-canaux} seront modulées utilisant à la fois de Ca ^{2 +-canal} agonistes et antagonistes pour évaluer les changements du signal concomitant.

Protocol

Étiquetage de manganèse de cellules souches embryonnaires humaines Trypsiniser les tiges embryonnaires humaines qui ont été cultivées dans des conditions exemptes d'alimentation pendant 5 minutes. Neutraliser la trypsine en ajoutant des milieux de culture. Isoler les cellules par centrifugation à 800 rpm pendant 5 minutes à 20 ° Celsius. Après remise en suspension du culot cellulaire, compter le nombre de cellules par coloration au bleu trypan. Basé sur le nombre de cellules obtenues, d…

Discussion

Ces résultats indiquent que le manganèse ne pénètrent par le canal calcique voltage-dépendants, et le manganèse peut être utilisé comme agent de contraste IRM, qui peut également montrer la viabilité cellulaire. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de cellules souches embryonnaires humaines dans le myocarde.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	Gibco	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	Gibco	11330
2- mercaptoethanol 98+%	Reagent	Sigma	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	Gibco	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	Gibco	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	Gibco	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Medical Systems
clinical Knee coil	Tool	GE Medical Systems
DPBS	Reagent	Gibco	14190