Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC 's van MEFs op Matrigel
Summary
Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.
Abstract
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen, hoe passage hESC' s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen.
Protocol
Discussion
Deze video laat zien hoe passage hESC 's van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat te bevestigen in feeder-vrije kweekomstandigheden.
Acknowledgements
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | Gibco | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | Gibco | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | Gibco | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | Gibco | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | Gibco | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | Gibco | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | Gibco | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc. | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
