La MODS método para el diagnóstico de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente
Summary
La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la tuberculosis (TB) y la tuberculosis multirresistente (TB-MDR). Este vídeo describe el líquido MODS medios método de cultivo.
Abstract
Los pacientes con tuberculosis pulmonar activa (TB) infectan 10-15 personas por año, por lo que el diagnóstico de tuberculosis activa esencial tanto para la curación del paciente y prevenir nuevas infecciones. Por otra parte, la aparición de tuberculosis multirresistente (TB-MDR) significa que la detección de resistencia a los medicamentos es necesario para detener la propagación de cepas resistentes. La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la TB y TB MDR. El ensayo MODS se basa en tres principios: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) crece más rápido en medios líquidos que en medios sólidos 2) el crecimiento de MTB microscópica puede ser detectado antes en medios líquidos de esperar a que el aspecto macroscópico de las colonias en medios sólidos, y que el crecimiento es característico de MTB, lo que le permite distinguirse de la contaminación por micobacterias atípicas o por hongos o bacterias 3) los medicamentos isoniazida y la rifampicina pueden ser incorporados en el ensayo de MODS para permitir la detección simultánea directa de la TB-MDR, obviando la necesidad de llevar a cabo la subcultura una prueba indirecta de la susceptibilidad de drogas. La competencia de diagnóstico actuales se ven obstaculizados por la baja sensibilidad con frotis de esputo, las largas demoras hasta el diagnóstico con medio de cultivo sólido, con el costo prohibitivo de los actuales métodos de cultivo líquidos medios de comunicación, y la necesidad de hacer la subcultura de las pruebas indirectas para detectar sensibilidad a los medicamentos TB MDR. En contraste, el método no-propietario MODS tiene una alta sensibilidad para la TB y TB MDR, es un método de cultivo relativamente rápido, proporciona pruebas simultáneas sensibilidad a los medicamentos para la TB-MDR, y se puede acceder a recursos limitados, en poco menos de $ 3 para las pruebas de tuberculosis y TB-MDR.
Protocol
Discussion
El ensayo MODS está dirigido a entornos de recursos limitados. Por primera vez, trae la posibilidad de MODS para la detección rápida de cultivo líquido de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente a los entornos con recursos limitados en poco menos de 3 dólares por prueba. MODS es un no-propietario, metodología iterativa, y la comunidad de MODS está siempre interesada en las mejoras que otros laboratorios han logrado hacer.
Una preocupación recurrente es la bioseguridad de los medios de cultivo líquidos de la tuber…
Acknowledgements
Queremos agradecer a Sean Fitzwater y Giannina Carmen Luna Colombo para el segmento de crecimiento de la tuberculosis de vídeo time-lapse. Damos las gracias a Marty Roper por su respuesta exhaustiva y excelente durante la edición y la co-autoría de la Guía del usuario, de donde se tomó el actual protocolo sobre todo palabra por palabra. Producción de este video fue financiado por el NIH / Centro Internacional Fogarty http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore contribuyó como miembro Wellcome Trust de Investigación Clínica en Medicina Tropical y Enfermedades Infecciosas en el lector en el Imperial College de Londres (Fellowship premio número 078067/Z/05). Mark F. Brady contribuido como miembro del NIH / Fogarty International Research Center.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; does not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma 99 | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
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