Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas

Summary

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado.

Abstract

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado. En primer lugar, de uno a dos días de edad diez placa cm de aproximadamente una (o dos) millones de embriones de ratón irradiado células alimentadoras de fibroblastos se enjuaga con medios tonos para eliminar el suero residual y los desechos celulares, y luego los medios de comunicación HUES y se deja que se equilibre en el celular incubadora de cultivo. Un vial congelado de las células de almacenamiento a largo plazo o en el congelador de nitrógeno líquido a-80C es de origen y se sumerge rápidamente en un baño de agua 37 º C para la descongelación rápida. Las células en los medios de congelación se retira del vial y colocada en una gran cantidad de medios tonos. El gran volumen de los tonos medios de comunicación facilita la eliminación del exceso de suero y DMSO, que puede causar HUES células madre embrionarias humanas para diferenciar. Las células son suavemente se salió de la suspensión, y luego volvió a suspender en un pequeño volumen de los medios de comunicación HUES dulce que se utiliza para sembrar la placa MEF. Se considera importante que la semilla de la placa MEF añadiendo lentamente las células tonos en forma gota a gota de manera uniforme a dispersarse por todo el plato. La placa de reciente creación HUES cultura se devuelve a la incubadora durante 48 horas antes de que los medios de comunicación se sustituye, a continuación, se alimenta cada 24 horas después.

Protocol

Deshielo de un stock congelado: Antes de descongelar las células de colores, asegurarse de que la placa MEF ya ha preparado adecuadamente es plateado y en buenas condiciones. NO trate de utilizar una placa de menos deseables, o uno que tiene más de tres días. Se recomienda que antes de la etiqueta de todos los tubos cónicos y los pozos que se utiliza. Pre-cálidos tonos medios de comunicación a 37 ° C. HUES m…

Discussion

En este vídeo, se muestra cómo nuestro laboratorio de rutina establece un HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de una masa congelada. Este proceso es susceptible de uso general en cualquier célula de mamífero si es congelado en una solución de DMSO. Descongelación eficiente es esencial para establecer una nueva cultura de las células de tonalidades de un stock congelado, y es importante para la consistencia experimental.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 ml beta-mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml