Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов
Summary
Это видео демонстрирует, 2-цветный целом монтировать на месте гибридизация, метод, которым пространственной и временной экспрессии в 2 разные гены могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Дэвид Уилкинсон, Домингос Энрике, Фил Ингам и Дэвид Иш-Horowicz.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения экспрессии генов в мозге, нервной трубки, сомитов и формирование зачатков сердца. Это видео демонстрирует различные этапы в 2-х цветный целом монтировать на месте гибридизации; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эмбрион обрабатывается для prehybridization. Эмбрион, то гибридизированных с двумя различными датчиками, один связан с DIG, а один связан с FITC. После ночи гибридизации, эмбрион инкубировали с антителами DIG связаны. Цветная реакция на подложке DIG выполняется, и область интереса появляется синий. Эмбрион затем инкубировали с FITC связанных антител. Эмбриона обрабатывается для цветной реакции с FITC, и область интереса появляется красное. Наконец, эмбрион является фиксированной и обработаны для phtograph и секционирования. Руководство по устранению неисправностей также представлен.
Protocol
Discussion
2-цветная целом монтировать на месте методом гибридизации используется для определения пространственных и временных закономерностей изменения экспрессии генов, с помощью одного или двух генов, представляющих интерес. Приложения включают в себя оценку генной экспрессии новых генов (например, <sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher | ||
| SDS | Reagent | Fisher | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| Boehringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Applied Sciences | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson Immuno | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Applied Sciences | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
