Ett beteende analys för att mäta lyhördhet Zebrafish till förändringar i ljusintensiteter
Summary
Vi utvecklade Visual-Motor Svar kvantifiera motorn produktion av larver zebrafisk som svar på lätta steg och minskningar. Vi har även granskat zebrafisk visioner mutanterna, inklusive några optokinetic svar (NRC) mutanter, som var tänkt att vara helt blind när den testas av en annan syn analys, den optokinetic reflex.
Abstract
Den optokinetic reflex (okr) är en grundläggande visuell reflex ut av de flesta ryggradsdjur och spelar en viktig roll för att stabilisera ögat i förhållande till den visuella scenen. Kräver dock okr att ett djur upptäcka rörliga ränder och det är möjligt att fisk som inte uppvisar ett okr kanske inte är helt blind. En zebrafisk mutant, no optokinetic svar c (NRC) har ingen okr under några ljusförhållanden testade och rapporterades vara helt blind. Tidigare har vi visat att OFF-gangliecell aktivitet kan registreras i dessa mutanter. För att avgöra om mutant fisk utan okr som NRC mutanten kan upptäcka enkla lätta steg och Minskar vi utvecklat den visuella motoriska beteende analys (VMR). I denna analys, är ensamstående zebrafisk larver placeras i varje brunn på en 96-brunnar är möjligt att samtidigt övervaka larver med hjälp av en automatiserad video-tracking system. Den rörelseapparaten svar på varje larv till 30 minuter tända och 30 minuter lampan spelades in och kvantifieras. WT fisk har en kort spik i motorisk aktivitet vid ljus på, känd som reaktion på plötsliga ljud, följt av återgång till lägre än utgångsvärdet aktivitet, en så kallad frysning. WT fisk också kraftigt öka sin rörelseaktivitet omedelbart efter belysningen och endast gradvis (under flera minuter) återgår till utgångsläget rörelseaktivitet. NRC mutanter reagerar liknande till lampan som WT fisk, men uppvisar en liten minskning av deras genomsnittliga aktivitet jämfört med WT fisk. Motorisk aktivitet som svar på ljus ON i NRC mutanter är försenat och trög. Det är en långsam stigtid för NRC mutant reaktion på ljus PÅ jämfört med WT ljus PÅ svar. Resultaten tyder på att NEO fisk inte är helt blinda. Eftersom teleosts kan detektera ljus genom icke-retinal vävnader, bekräftade vi att den omedelbara beteendemässiga reaktioner på ljus intensitet förändringar kräver intakt ögon genom att använda chokh (CHK) mutanter, som helt saknar ögon från de tidigaste stadierna av utveckling. I vår VMR analysen av CHK mutanter uppvisar ingen reaktion vid oväntade yttre antingen ljus PÅ eller AV, visar att den laterala ögon förmedla detta beteende. I VMR-analysen som beskrivs här kompletterar de väletablerade okr assay, som inte testar förmåga zebrafisk larver att svara på förändringar i ljusintensiteter. Dessutom lånar automatisering av VMR analysens sig till high-throughput screening för fel i ljus-intensitet driven visuell svar.
Protocol
Discussion
Den experimentella procedurer vi visar i filmen är alla representativa för WT fisk. Dock kan dessa försök göras analogt på mutant fisk samt (se avsnitt representativt resultat). Vi föreslår till tallrik WT fisk och muterade fisk på samma tallrik i en Checker Board översikt för optimal kontroll.
När du använder mutant fisk på samma tallrik som WT fiskar se till att du skriver ner vilken typ av fisk var klädd i varje brunn. Här är ett förslag på hur man håller koll på fisken pläterade i varje brunn (Visa anteckni…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag EY0081 och 5T32UY07145 och av Tempelherreorden Eye Foundation. Jason Rihel är en Bristol-Squibb Fellow Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
References
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
