Метилированный Иммунопреципитация ДНК
Summary
Это видео демонстрирует протокол для метилированной иммунопреципитации ДНК (MeDIP). MeDIP является двухдневной процедуры, которые селективно экстракты метилированных фрагментов ДНК из генома образцов ДНК с использованием антител со специфичностью для 5-метилцитозин (анти-5 MC).
Abstract
Выявление закономерностей метилирование ДНК является обычной процедурой в изучении эпигенетика, как метилирование, как известно, оказывают значительное влияние на экспрессию генов, и участвует с нормальным развитием, а также болезни<sup> 1-4</sup>. Таким образом, способность различать метилированной ДНК и неметилированных ДНК имеет важное значение для создания профилей метилирования для таких исследований. Метилированный ДНК иммунопреципитации (MeDIP) является эффективным инструментом для извлечения метилированной ДНК из образца интерес<sup> 5-7</sup>. Образец всего за 200 нг ДНК достаточно для антитела или иммунопреципитации (IP), реакции. ДНК ультразвуком на фрагменты размером от 300-1000 б.п., и разделен на иммунопреципитации (IP) и ввода (IN) порциями. IP ДНК впоследствии тепла денатурированного и затем инкубировали с анти-5'mC, позволяя моноклональных антител связываться метилированную ДНК. После этого, магнитных гранул содержащих вторичные антитела с сродством к первичным антителом добавляются, и инкубировали. Эти бусины-связанными антителами будет связывать моноклональные антитела, используемые в первом шаге. ДНК связана с антителом комплекс (метилированной ДНК) отделен от остальной части ДНК, используя магнит тянуть комплексов из раствора. Несколько моет использованием IP-буфера Затем выполняется для удаления несвязанных, не метилированную ДНК. Метилированные ДНК / антитело затем переваривают протеиназы К переварить антитела, оставляя только метилированную ДНК нетронутой. ДНК, обогащенной очищают фенол: хлороформ добычи для удаления белка вещества и затем осаждаются и ресуспендировали в воде для дальнейшего использования. ПЦР методы могут использоваться для проверки эффективности MeDIP процедуры на основе анализа продуктов амплификации интеллектуальной собственности и В ДНК для регионов известны их недостаток и как известно, содержат метилированные последовательности. Очищенной метилированной ДНК может быть использована для локус-специфические (ПЦР) или генома (микрочипов и последовательности) метилирования исследований, и особенно полезен при использовании в сочетании с другими инструментами исследования, такие как ген профилирования выражения и массив сравнительной гибридизации генома ( CGH)<sup> 8</sup>. Дальнейшее расследование метилирование ДНК приведет к открытию новых эпигенетических цели, которая, в свою очередь, могут быть полезны в разработке новых терапевтических или прогностических инструментов исследования таких болезней, как рак, который характеризуется аберрантно метилированной ДНК<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Существует растущее осознание значительную роль метилирования ДНК играет в болезнь, поэтому развитие тесты для измерения этого изменения становятся все более важными 3, 12, 13. Техника MeDIP это поддается инструмент для скрининга на обоих целого генома и локус-определенного уровня <su…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Браун и Лам лабораторий для их участия в критике это видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств от канадских институтов по исследованиям в области здравоохранения и Майкл Смит фонда исследований в области здравоохранения.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
