Metillenmiş DNA Immunoprecipitation
Summary
Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.
Abstract
DNA metilasyon paternlerinin belirlenmesi epigenetik çalışma metilasyon gen ekspresyonu üzerinde önemli etkileri olduğu bilindiği gibi, ortak bir prosedür ve hastalığın yanı sıra normal gelişimi ile ilgili<sup> 1-4</sup>. Böylece, metil DNA ve non-metil DNA arasında ayrım yapma yeteneği, bu tür çalışmalar için metilasyon profilleri üreten için gerekli. Metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) ilgi bir örnek metillenmiş DNA çıkarılması için etkin bir tekniktir<sup> 5-7</sup>. DNA az 200 ng örnek bir antikor ya da immunoprecipitation (IP), reaksiyon için yeterli. DNA boyutu 300-1000 bp arasında değişen parçaları içine sonicated ve immunoprecipitated (IP) ve giriş (IN) kısımları ayrılır. IP DNA daha sonra, monoklonal antikor metillenmiş DNA bağlamak için izin denatüre ve sonra anti-5'mC inkübe ısı. Bundan sonra, primer antikor afinite ile ikincil bir antikor içeren manyetik boncuk eklenir ve inkübe edilir. Bu boncuk bağlanan antikorlar, ilk adımda kullanılan monoklonal antikor bağlanacaktır. Antikor kompleksi (metil DNA) bağlı DNA çözüm kompleksleri dışarı çekmek için bir mıknatıs kullanarak DNA geri kalanından ayrılır. IP tampon kullanarak birçok yıkar sonra ilişkisiz, non-metil DNA kaldırmak için yapılır. Metillenmiş DNA / antikor komplekslerini sonra sadece metillenmiş DNA zedelemeden antikorlar sindirmek için Proteinaz K ile sindirilir. Protein madde kaldırmak için kloroform ekstraksiyon ve daha sonra daha sonra kullanmak üzere çöktürülmüş ve su yeniden süspanse: fenol ile zenginleştirilmiş DNA arındırılır. IP amplifikasyon ürünleri analiz ederek ve eksikliği bilinen ve metil dizileri içerdiği bilinen bölgeler için DNA'nın MeDIP prosedürün etkinliğini doğrulamak için PCR teknikleri kullanılabilir. Saflaştırılmış metillenmiş DNA lokus spesifik (PCR) veya genom (mikroarray ve sıralama) metilasyon çalışmaları için kullanılan ve gen ekspresyon profili ve dizi karşılaştırmalı genom hibridizasyonu gibi diğer araştırma araçları ile birlikte uygulandığında (özellikle yararlıdır CGH)<sup> 8</sup>. DNA metilasyon içine daha fazla araştırma da, aberrantly metillenmiş DNA ile karakterize olan kanser gibi hastalıklar için yeni tedavi veya prognostik araştırma araçları geliştirilmesinde yararlı olabilir, yeni epigenetik hedefler, keşfine yol açacaktır<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Hastalığında önemli rol DNA metilasyon oynar büyüyen bir farkındalık vardır, bu nedenle testlerin geliştirilmesi, bu değişikliği ölçmek için 13, 12, 3 giderek daha önemli hale gelmektedir. MeDIP teknik tüm genomu ve lokus spesifik seviyesi 6, 7, tarama için bir mükellef araçtır . Bu teknik, DNA başlayan sınırlı miktarda kullanarak DNA metilasyon seviyelerini hızlı bir görünüm sağlar ve farklı kaynaklardan arasında kolay karşılaştırma için sağlar. MeDIP ürün…
Acknowledgements
Biz, bu video ve makale eleştirmeyi katılımları için Brown ve Lam laboratuvarları üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Michael Smith Sağlık Araştırma Vakfı Enstitüsü'nün fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
