Stöds Planar bilayers för bildandet av studier av immunologiska synapser och Kinapse

Summary

Stöds plana bilayers är kraftfulla verktyg som kan användas för att modellera molekylära interaktioner i en immunologisk synaps. Här visar vi metoder för att förankra proteiner celladhesion kända för att modulera synaps bildning till övre bipacksedel av lipid bilyer och visualisera synaps bildning med TIRF mikroskopi.

Abstract

Stöds plana bilayers är kraftfulla verktyg som kan användas för att modellera molekylära interaktioner i en immunologisk synaps. Att efterlikna samspelet mellan lymfocyter och antigenpresenterande celler, använder vi Ni2 +-kelatbildande lipider för att förankra rekombinant cell adhesion och MHC proteiner till övre bipacksedel en tvåskiktsmembran med poly-histidin taggar. Planar bilayers genereras genom att förbereda fett, behandla glasytorna där tvåskiktsmembran kommer att bilda, och sedan bildar tvåskiktsmembran i en särskild avdelning som innehåller ett flow-cell där lymfocyterna tillkommer. Sedan är bilayers laddade med Ni och hans-märkta rekombinanta proteiner läggs till. Slutligen lymfocyter injiceras i flödet cellen och TIRF mikroskopi kan användas för att bilden synaps bildning och de mekanismer som styr T-cell förflyttning, platser av receptor sortering, och platser av receptor nedbrytning.

Protocol

1. Förbereda lipider För att länka proteiner till den övre bipacksedel en tvåskiktsmembran använder vi Ni 2 + kelatbildande lipider, som ankare rekombinanta proteiner med poly-histidin taggar. Vissa celltyper kan fastna ospecifikt till Ni 2 +-belagda bilayers, men T-celler i allmänhet inte, vilket gör denna metod optimal för att studera T-cell aktivering. Den membranet lösning gjorts genom att förbereda en lösning av 20% Ni 2 + komplexbildare fett och 80% …