Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

Hola, soy Judy Yen del laboratorio de Kate Rubins en el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica. Después de infectar las células hela con el virus vaccinia y aislar el ARN total, como se muestra en una publicación anterior del protocolo de video de Joe y el ARN viral se puede aislar y amplificar mediante transcripción inversa e in vitro, el ARN amplificado se utilizará más adelante en el análisis de microarrays de la expresión génica viral y del huésped. Así que comencemos.

Para comenzar esta síntesis de c cd NA a partir del ARN, agregue el volumen recomendado de etanol al cien por cien a los tampones de lavado antes de usar el kit AMP dos de mensaje de alelo amino ambiental en un tubo de reacción de PCR, agregue entre 100 nanogramos a cinco microgramos de ARN total y un microlitro de cebador T seven oligo. Lleve el volumen hasta 12 microlitros con agua libre de nucleasas. Incubar las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos en un termociclador.

A continuación, retire las muestras de ARN a 70 grados centígrados en una centrífuga. Brevemente, después de la centrifugación, coloque las muestras en hielo. Prepare la primera mezcla maestra de síntesis de hebras con un 10% de exceso de volumen para cubrir el error de edición de tuberías.

Déjelo a temperatura ambiente, pipetee suavemente la mezcla maestra o mezcle para mezclar, y luego centrifugue brevemente después de la centrifugación, transfiera ocho microlitros de la mezcla maestra a cada muestra de ARN mezclada por tubería sumando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces incubadas a 42 grados Celsius durante dos horas en termociclador. Después de la incubación, centrifugar las muestras brevemente en su lugar sobre hielo. Proceda inmediatamente al siguiente paso de la síntesis DS dsd A.

Prepare la mezcla maestra de síntesis de la segunda hebra en hielo con una sobretasa de volumen del 10% para compensar el error de pipeteo, pipetee suavemente la mezcla maestra o mueva el aix y luego centrifugue brevemente después de la centrifugación. Transfiera 80 microlitros a cada muestra y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Incubar a 16 grados centígrados durante dos horas en el termociclador.

Después de las dos horas de incubación, proceda con el paso de limpieza de CDNA o congele inmediatamente a 20 grados centígrados negativos. Para comenzar la limpieza de CD NA de doble cadena. Primero, retire el ADNc puro del refrigerador y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo, agite la botella para resuspender completamente las perlas magnéticas de unión de CD NA antes de usar agua sin nucleasa alícuota en un tubo de 1,5 mililitros e incube a 50 a 60 grados centígrados durante al menos 10 minutos.

Durante las dos horas anteriores de incubación, agregue 180 microlitros de CD NA puro a cada muestra y mezcle bien con una pipa agregando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las muestras a una placa inferior redonda de 96 pocillos. Después de que las muestras se hayan transferido a una placa, continúe mezclando las muestras agitando suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos.

Mueva la placa a un soporte magnético para capturar las cuentas magnéticas. Deje el plato en el soporte durante aproximadamente seis minutos o hasta que la mezcla se vuelva transparente y las cuentas de unión se hayan granulado. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar las perlas magnéticas.

Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Después de desechar el sobrenadante, retire la placa del magnetismo. A continuación, colóquese a 150 microlitros, tampón de lavado CDNA en cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad moderada.

Las perlas no se dispersarán en este paso debido a la baja tensión superficial del tampón de lavado. Después de agitar, vuelva a colocar la placa en un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas, aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar las perlas magnéticas.

O retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético. Repita el lavado por segunda vez con 150 microlitros, tampón de lavado CDNA.

Después del segundo lavado, seque las perlas agitando la placa durante dos minutos en el agitador orbital a la velocidad máxima. Es importante no dejar que las cuentas se sequen demasiado. A continuación, eluya el CDNA de las perlas añadiendo vigorosamente 18 microlitros de agua libre de nucleasa precalentada a cada muestra.

Agite la placa durante tres minutos en el agitador orbital. A continuación, comprueba que las perlas magnéticas están completamente dispersas. Si no es así, sigue temblando.

Una vez que las perlas magnéticas estén completamente dispersas, mueva la placa a un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas, transfiera con cuidado el cd NA eluido a una nueva placa de PCR o tubos de PCR. Deberías estar recuperando aproximadamente 16 microlitros del elucian per.

Bueno, proceda directamente al siguiente paso o congele el cd NA a menos 20 grados centígrados. Prepare la mezcla maestra IVT a temperatura ambiente. Pipetee suavemente la mezcla maestra o pase para mezclar y centrifugar brevemente.

Después de la centrifugación, agregue 24 microlitros a cada muestra y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces incubada, a 37 grados centígrados durante 14 horas en un termociclador. Luego manténgalo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para el siguiente paso, agite brevemente las perlas de unión de ARN para obtener una mezcla uniforme antes de usar. Prepare la mezcla de unión al ARN A a temperatura ambiente.

Esto se puede hacer con anticipación. La mezcla aglutinante preparada se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por una semana. Mezcle bien mediante vórtice alícuota el tampón de elución de ARN A en un tubo de 1,5 mililitros en incubación a 50 a 60 grados Celsius durante al menos 10 minutos.

Ahora, agregue 70 microlitros de la mezcla de unión al ARN A a cada muestra y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Transfiera las muestras de la placa de PCR a una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, agregue 50 microlitros de isopropanol al cien por cien a cada muestra y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces.

Agite suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos. Para mezclar completamente las muestras, mueva la placa a un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas.

Deje el plato en el soporte hasta que la mezcla se vuelva transparente y las cuentas de unión se hayan granulado. Después de que las perlas se hayan granulado, aspire cuidadosamente el sobrenadante con el aspirador de vacío sin perturbar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.

Retire la placa del soporte magnético. A continuación, agregue 100 microlitros de una solución de lavado de ARN a cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital A velocidad moderada, las perlas no tienen que dispersarse por completo. En este paso, mueva la placa a un soporte magnético.

Para capturar las perlas magnéticas. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.

Una vez que se haya retirado el sobrenadante, retire la placa del soporte magnético. Repita el lavado por segunda vez con 100 microlitros, una solución de lavado de ARN. Después del segundo lavado, seque las perlas agitando la placa durante un minuto en el agitador orbital a la velocidad máxima.

Recuerde no secar demasiado las muestras para eluir el ARN A de las perlas añadiendo 40 microlitros del tampón de elución de ARN A precalentado. A cada muestra, agite enérgicamente la placa del agitador orbital durante tres minutos. A continuación, comprueba que las perlas magnéticas están completamente dispersas.

Si no es así, sigue temblando. Una vez que las cuentas magnéticas se hayan dispersado por completo, mueva la placa a un soporte magnético para capturar las cuentas magnéticas. El súper natan contiene el alelo amino limpio, incorporado a un ARN.

Transfiera con cuidado una NA eludida a una nueva placa de PCR o tubos de PCR. En este punto, puede verificar la concentración de ARN de las muestras midiendo 1,5 microlitros en un espectrofotómetro NanoDrop. Continúe inmediatamente con el siguiente paso o almacene el A NA a menos 80 grados centígrados.

Acabamos de mostrarle cómo marcar con fluorescencia muestras de ARN incorporadas a alelos inmunológicos amplificados para la hibridación de microrayos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que no se recomienda realizar una segunda ronda de amplificación. A medida que se han observado sesgos y datos de matrices, también es importante recordar que mezclar cuidadosamente en cada paso enzimático sugiere la primera y segunda hebra.

La síntesis de CDNA, o la etapa IVT, es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, al igual que la incubación de cada etapa enzimática a la temperatura adecuada. Es preferible un ciclador de PCR con una tapa calentada ajustable, ya que incluso hay desviaciones tan pequeñas como dos o tres grados durante la transcripción in vitro. En un horno de hibridación de aire o baño de agua, la hibridación puede afectar significativamente el rendimiento del producto amplificado.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos. Asegúrese de ver los otros videos de esta serie donde mostramos cómo realizar una infección de curso de tiempo con el virus vaccinia y la extracción de ARN de las muestras y la preparación y limpieza del ARN marcado con fluorescencia.