الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

مرحبا ، أنا جودي واي من مختبر كيت روبينز في معهد وايتهيد للأبحاث الطبية الحيوية. نوضح هنا كيفية تسمية عينات الحمض النووي الريبي المضادة للمعنى التي تم جمعها من كل من خلايا هيلا المصابة بفيروس اللقاح والفيروسات عن طريق اقتران الأصباغ الأمينية لجميع المدار الأرضي المنخفض. ثم نوضح كيفية تنظيف الحمض النووي الريبي المسمى A وإعداده ليتم تهجينه لتحليل المصفوفات الدقيقة للتعبير الجيني.

مقاطع فيديو Joe السابقة الضوء على كيفية إجراء العدوى الفيروسية ، والعزل الكلي للحمض النووي الريبي ، وخطوات تضخيم وتضخيم الحمض النووي الريبي. لذلك دعونا نبدأ. لبدء وضع العلامات على الحمض النووي الريبي ، أضف أولا ميكروغراما واحدا من عينات الحمض النووي الريبي A إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر.

جفف العينات بالمكنسة الكهربائية على نار منخفضة أو بدون نار حتى تجف تماما. قم بتغطية كل أنبوب بمجرد أن يجف. من المهم عدم الإفراط في تجفيف العينات بعد تجفيفها.

أضف تسعة ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران إلى كل أنبوب وأعد تعليق الحمض النووي الريبي A عن طريق الدوامة برفق لمدة دقيقة واحدة من أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينة في قاع الأنبوب ثم ترك العينة على الجليد. بعد ذلك ، أضف 22 ميكرولتر DMSO عالي الجودة إلى كل أنبوب من SCI ثلاثة أو S خمسة صبغة أنبوب واحد من الصبغة يكفي لعينتين. يموت S SI الثلاثة لوضع العلامات على العينات المرجعية الخاصة بك والصبغة الخمسة SCI لوضع العلامات على عينات الاختبار الخاصة بك.

دوامة الأصباغ لخلطها جيدا. تذكر أن تحتفظ بالأصباغ في الظلام حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لا تحضر الصبغة قبل ساعة واحدة من الاستخدام وتأكد من عدم دخول الماء إلى مزيج الصبغة DMSO في أي وقت.

الآن عند 11 ميكرولترا من خليط الصبغة المحضر D-M-S-O-S لكل عينة ، يتم خلطها جيدا عن طريق الدوامة. احتضنها برفق لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية العينات بورق القصدير أو احتفظ بها في درج لتقليل التعرض للضوء.

بعد الحضانة عند 4.5 ميكرولتر هيدروكسي لامين لكل عينة لإخماد التفاعل الممزوج جيدا عن طريق الدوامة. احتضن برفق لمدة 15 دقيقة أخرى من درجة حرارة المكنسة. قم بتغطية العينات بورق القصدير أو احتفظ بها في درج لتقليل التعرض للضوء.

لتنظيف الملصق ، قاموا بدوامة الحمض النووي الريبي ، حبات ربط الحمض النووي الريبي. لفترة وجيزة للحصول على خليط متساو قبل الاستخدام ، قم بإعداد مزيج ربط الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة. امزج مزيج الربط جيدا عن طريق دوامة المخزن المؤقت لشطف الحمض النووي الريبي A في أنبوب سعة 1.5 مليلتر وتحضنه من 50 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.

أضف 70 ميكرولترا من مزيج ربط الحمض النووي الريبي A إلى كل عينة واخلطها جيدا عن طريق إضافة الأنبوب لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات بعد الخلط ، وانقل العينات من لوحة PCR إلى لوحة سفلية مستديرة 96 بئر. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الأيزوبروبانول بنسبة مائة بالمائة إلى كل عينة واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات. رج الطبق برفق على شاكر مداري لمدة دقيقتين على الأقل.

لخلط العينات جيدا. انقل اللوحة إلى حامل مغناطيسي. لالتقاط الخرز المغناطيسي.

اترك الطبق على الحامل حتى يصبح الخليط شفافا ويتم تكوير حبيبات الربط. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام شفاط فراغ دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وتخلص من المادة الطافية.

يجب أن يكون المادة الطافية إما بلون وردي فاتح أو أزرق فاتح في هذه المرحلة بسبب جزيئات الصبغة غير المدمجة. بمجرد التخلص من المادة الطافية ، قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي. أضف الآن مائة ميكرولتر ، محلول غسيل الحمض النووي الريبي لكل بئر وقم بهز اللوحة لمدة دقيقة واحدة على شاكر المداري بسرعة معتدلة.

قد لا تتشتت الخرزات بالكامل في هذه الخطوة ، أعد اللوحة إلى حامل مغناطيسي. لالتقاط الخرز المغناطيسي. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام شفاط فراغ دون إزعاج الخرز المغناطيسي.

بدلا من ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وتخلص من المادة الطافية. قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي. كرر الغسيل مرة ثانية باستخدام 100 ميكرولتر ، محلول غسيل الحمض النووي الريبي.

بعد الغسيل الثاني. جفف الخرزات عن طريق هز اللوحة لمدة دقيقة واحدة على شاكر المداري بأقصى سرعة. لا تفرط في تجفيف العينات ، وتتخلص من الحمض النووي الريبي A من الخرزات عن طريق إضافة 20 ميكرولترا مسخنا مسبقا ، وهو مخزن مؤقت لشطف الحمض النووي الريبي.

لكل عينة هز اللوحة بقوة على شاكر المداري لمدة ثلاث دقائق. ثم تحقق للتأكد من أن الخرزات المغناطيسية مشتتة بالكامل. إذا لم يكن كذلك ، فاستمر في الرج.

بمجرد تشتيت الخرزات المغناطيسية بالكامل ، انقل اللوحة إلى حامل مغناطيسي لالتقاط الخرز المغناطيسي. يحتوي المادة الطافية على عينات الحمض النووي الريبي التي تم تنظيفها والتي تحمل علامة A ويجب أن تكون إما وردية شاحبة أو زرقاء شاحبة. بعد ذلك ، قم بنقل الحمض النووي الريبي المشار إليه بعناية إلى لوحة PCR جديدة أو أنابيب PCR.

في هذه المرحلة ، يمكنك التحقق من تركيز الحمض النووي الريبي وكمية الصبغة في العينات عن طريق قياس 1.5 ميكرولتر على مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. باستخدام وحدة المصفوفة الدقيقة ، قم على الفور بتهجين الحمض النووي الريبي المسمى A على منصة مصفوفة دقيقة من اختيارك. أو بدلا من ذلك ، يمكنك تخزين الحمض النووي الريبي المسمى A عند سالب 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزا للتهجين.

هذه قراءة تمثيلية لمقياس الطيف الضوئي ومخطط OD تم إنشاؤه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لقياس تركيز العينة ودمج الصبغة. يمكنك رؤية قمم OD عند 260 نانومتر لحساب تركيز العينات بالإضافة إلى القمتين حول 532 و 635 نانومتر التي تمثل الأصباغ الخمسة S3 و SCI على التوالي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تسمية عينات الحمض النووي الريبي المدمج في الأليل المناعي المضخم بالفلورسنت لتهجين الأشعة الدقيقة.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعادة تعليق الصبغة في DMSO قبل أقل من ساعة من الاقتران والتأكد من عدم دخول الماء إلى مزيج الصبغة DMSO لأنه سيتفاعل مع المجموعة النشطة على الصبغة. من المهم أيضا أن تتذكر عدم الإفراط في تجفيف الحمض النووي الريبي إذا لزم الأمر. يمكن تجفيف العينات إلى ميكرولتر إلى ميكرولتر بدلا من تجفيفها تماما ، ثم إعادة تعليقها جيدا في مخزن التوصيل أثناء تفاعل التوصيل.

حافظ على ردود الفعل في الظلام مع النقر من حين لآخر والدوران لأسفل إذا رغبت في ذلك. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.

تأكد من مشاهدة مقاطع الفيديو الأخرى في هذه السلسلة حيث نوضح كيفية إجراء العدوى بفيروس اللقاح واستخراج الحمض النووي الريبي للعينات وإجراء التضخيم الخطي لعينات الحمض النووي الريبي.