Name: 負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 14 s
Description: 学ぶ末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせたラット脊髄損傷修復法。神経栄養因子と酵素を用いて再生を促進し、軸索再生と機能回復を評価する神経再生医学の手法です。

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この作品は、NIH / NINDS助成NS26380とNS55976、クリフトファーリーブ麻痺財団と脊髄の研究のためのダニエルホイマン基金によってサポートされていました。医学脊髄研究センターのドレクセル大学は、この作業を完了するために使用されるコア機能をサポートしています。

顕微鏡手術のための1）の準備<ol><li>手術の駅は清潔で、楽器やアクセサリーの材料を設定する前に希釈漂白液で消毒する必要があります。ナショナルインスツルメンツは、手術前に1日オートクレーブと滅菌コンテナに格納されます。別の動物での手続きの間に楽器から病原体や微生物汚染物を除去するために使用されるホットビーズ滅菌器（ファイン科学のツール）をオンにします。 </li><li>遮熱のプラグインは、手術中、体温を維持するために使用。出血を制御するために使用する綿棒やガーゼのパッドを設定します。滅菌生理食塩水でマイクロ止血および浸漬に使用するジェルの泡の小さい（&lt;2ミリメートル3）ピースを準備。 </li><li>場所の誘導室でラットやイソフルランで麻酔をかける（5％が酸素で気化、流量2.0 L /分）。チャンバーから準備テーブルに動物を削除し、意図した手術野からの毛皮の広い面積を削る。フィールドの中央に70％イソプロピルアルコールの始まりで拭きますと同じ方法でPolyhydroxidineソリューション（Xenodine）を使用してスクラブに続いて、外側に放射。洗浄3回のこのシーケンスを繰り返します。 </li><li>遮熱の上に置いて動物、吸入のコーンで鼻と口をカバーし、0.2 L /分に3％、流量にイソフルラン減らす。筋肉内注射で皮下注射と鎮痛剤（ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重）で抗生物質の適切な投与量（アンピシリン）を実現。 </li><li>外科医はXenodineソリューションで手をこすり、水ですすいでくださいなります。滅菌外科用ガウンは、外科医に付属となります。ハンドは滅菌タオルで乾燥し、滅菌手袋で覆われる。この手順は、このテキストで説明されている各手術のために続いている。 </li><li>滅菌器具をカバーする蓋は、外科医によって滅菌布の上にレイアウトされるアシスタントと楽器によって削除されます。 </li></ol> 2）PNの切除は、変性を促進する<ol><li>動物は、横倒しに平行な直線を維持膝に向かって大腿骨頭から切開し、大腿骨から約3mmを行います。基本となる外側広筋を公開する、皮膚の切開と同じラインに沿って浅大腿二頭筋を通してカット。 </li><li>使用してはさみは膝に近い外側広筋に小さなカットを行い、大腿骨頭に向けて、これを延長することができる。坐骨神経の結合した脛骨と腓骨神経の枝が可視化されるまで再びはさみで軽く（大腿骨と平行に走る）外側広筋を分離。 </li><li>坐骨神経のメイントランクが識別されるまで、大腿骨頭に向けてこれらの枝をたどる。ちょうど坐骨神経の分岐の下に（これが大きな分岐である）脛骨神経の枝を周囲の結合組織（神経上膜を）慎重に分離するために微細な鉗子を使用してください。 </li><li>一旦単離さ脛骨神経の周りに6から0絹糸結紮をスリップして締めます。合字に吻側神経をトランセクトするマイクロはさみを使用してください。外側広筋を通して縫合線を渡すと結び目で結んでとめる。神経が7〜10日後に収穫されるときにこれは脛骨神経の切断面の容易な場所のためのラインを提供します。 </li><li>前の移植に脛骨神経の変性は、新鮮な神経の準備を行うよりも、軸索成長のためのより適切な環境を提供しています。 </li><li> 6から0絹縫合糸で外側広筋を閉じます。 6から0絹縫合糸で大腿二頭筋を閉じます。ミシェルの創傷クリップで皮膚を閉じます。イソフルランの流れをオフにする、遮熱にケージを保持するには吸入のノーズコーンと場所の動物を取り外して、アラートとアクティブになるとホームケージに戻ります。 </li></ol> 3）PNのセグメントを除去すると、 <ol><li>上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置。 </li><li>創傷クリップと、別の前の皮膚切開を削除します。この筋肉の縫合糸を通して外側広筋とカットを公開するために、表面的な筋肉の縫合糸を切断します。 </li><li>脛骨神経の端をカットし、神経から縫合糸を除去するために縫合線をトレースします。脛骨神経の15mmの長さから、神経上膜を細かく分析し、この遠位端を切って進むために微細な鉗子を使用してください。無菌のハンクス平衡塩溶液で神経のセグメントと浸すを削除します。 </li><li>これは異種移植の実験の場合はEuthasolの腹腔内注射により動物を安楽死させる。これは、後述するように自己移植実験、脚の筋肉と2.6で説明したように皮膚が閉じている）と頸部の脊髄損傷のために準備動物、である場合。 </li></ol> 4）子宮頸片側切断の傷害および移植日1 <ol><li>動物を麻酔、ひげをそるとINTENをきれいに上記のようDED手術野（1.3）。遮熱に動物を配置。 （1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。 </li><li>後頭部ノッチと著名なT​​2背椎のプロセスを見つけて、切開これらの外部ランドマークとの間の完全な長さにします。表面的な僧帽筋の正中線を切断し、基盤となる頚椎菱形筋の筋肉を分離。スプレッダーを挿入することによって離れて筋肉を保つ。 </li><li>深い棘上の筋肉は、背側椎体プロセスC4、C5とC6からカットしてください。使用してrongeursは右辺全体と脊髄の左側の内側部を露出させるC5の部分椎弓切除を行います。脊髄の正中線のランドマークとして有名な背静脈を使用してください。 </li><li>ピアス硬膜へのマイクロ手術用メスの刃または30ゲージの針を使用し、C5脊髄を介して切開を延長する。基本的なくも膜下および軟膜の小さな切開を加えます。 </li><li>プルアップガラスとマイクロカニューレは、組織を分離し、その除去を容易にするために穏やかな圧力とマイクロ鉗子を用いて、脊髄の背側、右側を吸引し始める。背側から腹側へと正中線から外側髄膜に完全である2 mm長空洞を作成するために脊髄の中間および腹側の部分まで継続。 </li><li>止血を達成するためにキャビティ内に生理食塩水に浸したゲルフォームを置きます。 </li><li>ハンクス溶液から末梢神経のセグメントを削除します。ゆっくりと神経のセグメントの近位3ミリメートルから神経上膜ピールと片側切断の病変のキャビティの吻側壁にこのエンドを並置する。硬膜の神経上膜を介して10から0縫合糸でセグメントを確保し、硬膜が移植片の移植端の上に閉じ縫合。 </li><li>サンドイッチ後の時点での保護と容易な分離のためのシラスティック膜（Biobrane）の2個の間で移植。 C6、C7とT1椎骨プロセスの横に配置します。脊髄や筋肉組織に末梢神経の端を並べるしないでください。 </li><li> 4から0縫合糸、創傷クリップとの密接な皮膚の切開と層の筋肉を閉じます。 </li><li>それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。 </li></ol> 21日目<ol start="11"><li>上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。神経移植を取り巻くシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。細かい鉗子と春のはさみと手術野から反映を使用してシラスティック膜から神経の慎重に自由長。 </li><li> C7椎体プロセスの右側の部分椎弓切除を行います。ピアースは、上記のように髄膜（4.4）と吸引によってC7脊髄の1 mm 3の背側象限の病変のキャビティを準備。止血を達成してから、コンドロイチナーゼABCに浸したゲルフォームを置き換えるために生理食塩水に浸したゲルフォームを使用してください。 5分ごとに新鮮なコンドロイチナーゼ浸したゲルフォームを提供し、15分間病変部位を扱います。 </li><li>シラスティック膜と神経移植片の外面の長さをカバーしています。 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。 </li></ol> 23日目<ol start="14"><li>上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。神経移植を取り巻くシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。移植を妨げるのではなく、C7のグラフトサイトを公開し、脊髄脊髄への移植の同格の遠位約1mmの右側にコンドロイチナーゼABCの1μlを微量注入するために引っ張らガラスカニューレでハミルトンシリンジを使用しないでください。 </li><li>ゆっくりと神経のセグメントの遠位2mmから神経上膜ピールとC7の病変の空洞にこのエンドを並置する。硬膜の神経上膜を介して10から0縫合糸でセグメントを固定します。 </li><li> 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。 </li></ol>移植片と遠位脊髄における活動電位の5）電気生理学的記録<ol><li>電気的活動をPNGに再生した軸索を介して送信されているかどうかを判断するためには、まず公開し、移植片を分離する必要があります。特別な注意が物理的に移植片の損傷を防ぐために、この手順の実行中に採取し、これは移植片の配置後のシラスティック膜の使用は重要であるであるする必要があります。上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。場所の目遮熱の電子の動物。 </li><li>皮膚を開き、表面的な筋肉を分離した後、シラスティック膜ストリップは特定され、慎重に移植の自由な解剖されています。 </li><li> rongeursを使用すると、すぐに吻側およびPNG -脊髄の同格のサイトへの尾背側椎プロセスを削除します。このアプローチの間にあまりにも多くの移植を邪魔しないように注意してください。両方のレベルで硬膜にスリットを作る。 </li><li> C5移植脊髄の同格のサイトに約1cm吻側は1mm程度の深さに、単一のワイヤ（プラチナイリジウムミックス）病変の同側の脊髄に刺激電極を、挿入する。バイポーラフック電極の上に移植片の中央部を慎重に持ち上げて、取り外します。 100μsecの期間で10μAのシングル刺激パルスを発生し、移植片の再分化している軸索を伝わる活動電位があるかどうかを判断します。 </li><li>フック電極は刺激電極となると、単一のワイヤが脊髄と脊髄での活動電位を記録する試みにPNGの同格の遠位脊髄に挿入されるように接続し、配線の位置を切り替えます。 </li><li>実験の終わりに1時間の合計については、50Hzに100μsecの期間中、1mAまでの刺激の列車を提供しています。後で1時間、動物を安楽死させる、PNGにおける再生軸索によって活性化されたニューロンの最高財務責任者（CFO）の免疫細胞化学的検出のための、4％パラホルムアルデヒドとプロセス脊髄組織を灌流。 </li></ol> 6）PNGと脊髄に戻って再生軸索の順行性標識に軸索を再生成するニューロンの逆行性標識法は、 <ol><li>電気生理学的な措置でテストされていない動物の場合には、脊髄に移植し、その終了のコースに成長する軸索のソースを識別することが可能です。上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、上記の6.1で説明したようにPNGを公開します。 </li><li>その中間点で移植を切ってと移植片の切断端部から神経上膜をバック除去するマイクロはさみを使用してください。カットは、お互いから離れて終わるとパラフィルムの別のシートにそれぞれのレイアウトが反映されます。 </li><li> PNGへの軸索に貢献ラベルのニューロンへの近位の切り口でトゥルーブルーに浸したゲルフォームの綿撒糸を置きます。脊髄への移植片の背面から伸びるラベルの軸索の遠位のカットの端にビオチン化デキストランアミン（BDA）に浸したゲルフォームの綿撒糸を置きます。 </li><li> 3 - 4dの後に動物を安楽死させる、4％パラホルムアルデヒドとプロセスの脳とトゥルーブルーというラベルのニューロンのためのまたは標識された軸索のためのBDAの組織化学のための蛍光顕微鏡のための脊髄の組織切片を浸み込ませる。 </li></ol> 7）胸部の完全切除の傷害および移植これは上記の頚椎片側切断損傷モデルへの代替アプローチを提供しています。ここではより深刻な、二国間の傷害が生成され、末梢神経のセグメントは、スパンの病変空洞や損傷した脊髄の吻側および尾切り株に配置されます。 日1 <ol><li>上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置。 （1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。 </li><li>最後の肋骨の挿入の時点でT12椎体レベルを識別します。脊椎のプロセスT11、T10とT9以上吻側この点から皮膚切開を行います。これら3つのプロセスに接続されている棘上の筋肉を通して浅筋膜を介してカット。 </li><li> T10椎体プロセス（覆うT12脊髄セグメント）の完全な椎弓切除を行います。ピアス硬膜へのマイクロ手術用メスの刃または30ゲージの針を使用し、T12脊髄を介して切開を延長する。基本的なくも膜下および軟膜の小さな切開を加えます。 </li><li>プルアップガラスとマイクロカニューレは、組織を分離し、その除去を容易にするために穏やかな圧力とマイクロ鉗子を使用して、二国間T12脊髄を吸引し始める。腹側と外側髄膜の間に完全に背側である3 mm長空洞を作成するために脊髄の中間および腹側の部分まで継続。 </li><li>止血を達成してから、コンドロイチナーゼABCに浸したゲルフォームを置き換えるために生理食塩水に浸したゲルフォームを使用してください。 5分ごとに新鮮なコンドロイチナーゼ浸したゲルフォームを提供し、15分間病変部位を扱います。 </li><li>ハンクのソリューションから、末梢神経のセグメントを削除します。ゆっくりと神経のセグメントの近位4mmから神経上膜を反映しており、ぴったりと脊髄の片側の吻側および尾切り株の間に収まるように長さをカット。脊髄の反対側に並列した第一接木セグメントと並んで2番目のセグメントを、置きます。縫合硬膜が移植された移植片を介して閉じられ、小さなで硬膜をカバーシラスティック膜の一部。 </li><li> 4から0縫合糸、創傷クリップとの密接な皮膚の切開と層の筋肉を閉じます。 </li><li>それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。 </li></ol>日3 <ol start="9"><li>上記のような意図手術野（1.3）剃るときれいに、動物を麻酔。遮熱に動物を配置し、（1.4）上記のように抗生物質と鎮痛剤を投与する。移植部位を覆うシラスティック膜を露出する表面的な縫合糸を切断します。移植を妨げるのではなく、移植片に尾部脊髄を露出し、脊髄脊髄への移植の同格の遠位約1 mmの各側面にコンドロイチナーゼABCの1μlを微量注入するために引っ張らガラスカニューレでハミルトンシリンジを使用しないでください。 </li><li> 4から0縫合糸、創傷クリップで皮膚切開で表面的な筋肉を閉じます。それは警告とアクティブになるとホームケージに遮熱とリターンのケージを保持しているの場所の動物。電気生理学的刺激と記録と上記のトレーサーとして5に記載されているラベル）と6）を実行します。 </li></ol> 8）代表の結果この手順が最適化されると末梢神経のセグメントは、密接にホスト脊髄と統合される。脊髄軸索の昇順と降順と、移植を入力して移植片の長さに相対的に平行な直線で成長し、一日あたり約1 mmの割合で移植片の先端部に拡張されます。コンドロイチナーゼは、周囲の瘢痕組織から抑制性プロテオグリカンを除去するために使用されている場合、遠位端に到達すると、軸索は、隣接する脊髄に浸透されます。機能的結合は、移植片内の軸索の刺激に対する脊髄ニューロンによる応答の電気生理学的および免疫細胞化学的検出によって決定されます。機能回復のための解剖学的な相関が戻って脊髄への神経移植を超えて拡張している軸索の数と長さをトレースすることによって評価されます。

<ol><li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li>
<li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li>
<li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li>
<li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li>
</ol>

<ol><li>実験の再現性のためには、脊髄損傷のレベルは、動物から動物への一貫性を保つことが重要です。したがって、椎弓切除のための適切な椎体プロセスを識別することが重要です。我々はこの研究のために片側切断または切除病変のモデルを使用しているため、病変の大きさは約または特定の脊髄路が負傷または脇に置いていたかどうか明確になります。 </li><li>これは成長する再生軸索のためのスペースを提供するために、末梢軸索の消化を開始するので、それが軸索の内部成長をサポートするいくつかの神経栄養因子を生成するためにシュワン細胞を活性化するので、末梢神経を移植する前に事前に変性されることが必要である。 </li><li>カットの初期配置は、脊髄組織への移植片の端部は内と外移植片の軸索の成長を最適化するために（移植片を損傷することなく）しっかりと行う必要があります。末梢神経の脊髄に移植して縫合で移植片を固定しての直接の同格は重要です。 </li><li>移植部位の周囲に細胞外マトリックスを変更するにはコンドロイチナーゼの使用この実験のもう一つの重要な機能です。脊髄損傷に反応して形成されたグリア瘢痕組織は、軸索の成長への構造的および化学的障壁である。瘢痕の抑制プロテオグリカン含有量のコンドロイチナー...

<table><tbody><tr><td>10-0 シルク縫合糸</td><td>ArosSurgical</td><td>T5A10N10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 シルク縫合糸</td><td>McKesson</td><td>2693</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>McKesson</td><td>483549</td><td></td></tr><tr><td>cFos抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7799</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化デキストランアミン</td><td>Invitrogen</td><td>D7135</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン (0.3mg/ml)</td><td>McKesson</td><td>12496075701</td><td></td></tr><tr><td>コンドロイチンアーゼABC</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>100332-1A</td><td></td></tr><tr><td>ユサゾール</td><td>ウェブスター動物病院</td><td>07-805-9296</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Henry Schein</td><td>209-1966</td><td></td></tr><tr><td>ミシェル創傷クリップ</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotraceキット</td><td>Invitrogen</td><td>N7167</td><td></td></tr><tr><td>トゥルーブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5891</td><td></td></tr><tr><td>ゼノダイン</td><td>ウェブスター動物病院</td><td>92201</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>強制運動ホイール</td><td>Lafayette Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TreadScanシステム</td><td>Clever System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>無限ホライゾン衝撃装置</td><td>精密システムおよび計測機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気刺激装置</td><td>Magstim</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

脊髄（SCI）への外傷はニューロン、運動感覚神経線維（軸索）経路と脳との通信の混乱の混乱の死を引き起こす。私たちの研究の目標の一つは、損傷部位間の接続を復元するために軸索再生を促進することである。これを達成するために我々は、坐骨神経のセグメントはどちら脊髄の損傷端部間に直接配置されているまたは病変を渡る橋を形成するために使用される技法を移植末梢神経（PN）を開発。このアプローチには、いくつかの利点が他の神経組織の移植と比較してある、再生軸索が特​​定のターゲットエリアに向かって指示することができる、再生成する軸索の数とソースが簡単にテクニックを追跡することによって決定される、移植片は、測定する電気生理学実験に使用することができます機能回復は、移植片の軸索に関連付けられ、そしてそれは、移植片拒絶反応の可能性を低減するために、自家神経を使用することが可能です。私たちの研究室では、同等の結果との両方の自己（ドナーとレシピエントが同じ動物である）と異種（ドナーとレシピエントが異なる動物である）移植を実施した。このアプローチは、急性および慢性の両方の怪我の状況で正常に使用されています。 PNの移植片の遠位端に到達する回生の軸索は、しばしば我々はSCIの領域を周囲の瘢痕組織に関連付けられている阻害分子を分解するコンドロイチナーゼのmicroinjectionsを使用するので、脊髄に戻って拡張するために失敗する。同時に、我々は、外因性の成長と栄養分子を提供することは脊髄に長い距離が軸索の再成長を促進することを見出した。数ヶ月は、移植後に我々は脊髄損傷動物の機能の回復を評価するために、解剖学的行動および電気生理学的、さまざまなテストを実行します。この実験的なアプローチは、いくつかの脊髄損傷モデルにおいて、傷害の異なるレベルで、異なる種（マウス、ラットおよびネコ）に成功しています。重要なことは、末梢神経移植術のアプローチは、急性と慢性的に負傷ニューロンで再生を促進するのに有効です。

脊髄への外傷は、脳との通信が中断されます。失われた接続を復元するために我々は、長距離の成長を促進するための阻害分子を除去する神経栄養因子とマトリックス調節酵素と組み合わせて再生繊維のために基体を提供するために、末梢神経移植片を利用しています。

脊髄損傷（SCI）は、ニューロンの死、運動および感覚神経線維（軸索）経路の断裂、および…の破壊を引き起こします。

末梢神経を脊髄損傷部位に移植するための準備は、移植の7〜10日前にPNGを前変性させることから始まります。ドナーラットから脛骨神経枝を切断します。吸引により、頚髄第5レベル（C5）の半切断を行います。ドナーラットからPNGを取り出し、病変腔の吻側壁に接するように配置し、縫合糸で硬膜に固定します。3週間後、C7部位に背側四分の一病変を作成します。グリア瘢痕のプロテオグリカンを消化させるため、CHABCを浸透させたゲルフォームを病変腔内に15分間留置します。2日後、病変部位に隣接してCHABCを微量注入し、PNGの遠位端を背側四分の一病変に接するように配置します。こんにちは、ジョン・ヒューラです。私はドレクセル大学医学部脊髄損傷研究センターのディレクターを務めています。私はヒューラ研究室のヴェロニカ・トム博士です。そして私はマーサ・ミーンです。hula labより。本日は、成体ラットの損傷した脊髄へ末梢神経片を移植する手順を実演します。当研究室では、脊髄損傷後の軸索再生および機能回復を研究するために、この手法を用いています。それでは、始めましょう。顕微鏡下手術の準備として、手術ステーションを消毒し、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌します。また、サーマルバリアおよび、微小止血用の2 mm³未満の小さなゲルフォームを用意してください。綿棒、ガーゼパッド、および手術器具を準備します。足指をピンチして、動物が完全に麻酔状態にあることを確認した後、麻酔をかけたラットを処置台に置きます。予定されている術野の広範囲にわたって除毛し、付属のテキストプロトコルに記載されている無菌洗浄法に従って手術部位を洗浄します。次に、ラットをサーマルバリアの上に置き、吸入コーンで鼻と口を覆い、イソフルランを3％に、流量を0.2 liters per minuteに下げます。適切な用量の抗生物質アンピシリンを皮下注射し、鎮痛剤ブプレノルフィンを筋肉内注射で投与します。末梢神経（PN）は、除去の7～10日前に切断して変性を促進させます。これにより、新鮮な神経標本よりも軸索伸展に適した環境が提供されます。pnの切断を開始するために、動物を側臥位にします。滅菌手袋に交換し、手術部位の周囲に滅菌ドレープを掛けます。大腿骨頭から膝に向かって直線的に切開し、大腿骨から約3 mmの間隔を保ちながら平行に切開します。皮膚切開と同じラインに沿って浅層のbiceps fems筋肉を切断し、下層にあるvastus lateralis筋肉を露出させます。外側広筋を露出させた後、膝に近い位置でハサミを用いて小さく切開し、そのまま大腿骨頭に向かって切開線を伸ばします。リトラクターで外側広筋を慎重に分離し、大腿骨に並行に走行する坐骨神経の脛骨神経枝と比腓骨神経枝が視認できるまで広げます。次に、これらの神経枝を大腿骨頭に向かって辿り、坐骨神経の本幹を特定します。坐骨神経の分岐直下で、微細鑷子を用いて脛骨神経枝を囲む結合組織または神経外膜を慎重に分離します。こちらが太い方の枝です。脛骨神経枝を単離したら、6-0シルク結紮糸をその周囲に滑り込ませ、締め付けます。マイクロ剪刀を用いて、結紮部位まで神経の切り端を切断します。縫合糸を外側広筋に通して結紮します。これにより、切断された脛骨神経の末端を容易に特定するための目印となります。神経を採取します。その後、外側広筋を6-0シルク縫合糸で縫合します。続いて、上腕二頭筋を6-0シルク縫合糸で縫合します。最後に、Michelle皮膚縫合クリップで皮膚を閉じます。イソフルランの供給を停止し、吸入用ノーズコーンを取り外します。動物をサーマルバリア（保温材）を敷いた保持ケージに入れます。動物をホームケージに戻します。7〜10日後、動物が覚醒し活動的になった時点で、PNセグメントの採取が可能になります。移植を開始するために、麻酔をかけた動物をサーマルバリアの上に置きます。動物が完全に麻酔状態にあることを確認した後、創傷クリップを取り外し、皮膚切開部を広げます。皮膚を容易に剥離させ、汚染を避けることができるため、事前の除毛は必ずしも必要ではありません。被毛を切断する必要がないため、浅層筋肉の縫合線を切断して外側広筋を露出し、さらにこの筋肉内の縫合線を切断します。縫合線を脛骨神経の切断端まで辿り、神経から縫合糸を取り除きます。精密ピンセットを使用して、脛骨神経の15 millimeterの範囲で神経外膜を剥離し、この遠位端を切断します。神経セグメントを取り出し、滅菌済みのHank's平衡塩溶液に浸します。次のステップである、PN移植のための脊髄損傷の誘導への準備が整いました。PN移植は自家移植または他家移植のいずれかで行うことができます。麻酔をかけたラットをサーマルバリア上に配置し、前節で述べたように抗生物質と鎮痛剤を投与して、脊髄の片側切断損傷を誘導します。まず、後頭切痕と、突出した第2胸椎（T2）の背側椎突起の位置を確認します。これらの外的な指標間の全域にわたって切開を加えます。浅層の僧帽筋の中線を切開し、その下にある頸部深筋を分離します。開創器を挿入して筋肉を広げた状態に保ちます。深層の脊髄上筋を、C4、C5、およびC6の背側椎突起から切除します。R jurorsを用いてC5の部分的な椎弓切除を行い、脊髄の右側全体および左側の内側部分を露出させます。脊髄正中線の指標として、顕著な背側静脈を使用してください。次に、マイクロメスを用いて硬膜を穿刺し、C5脊髄にかけて切開線を広げます。引き伸ばしたガラスマイクロカニューレを用いて、その下のクモ膜下腔および軟膜に小さな切開を加えます。緩やかな圧力をかけながら、マイクロピンセットで組織を剥離して除去しやすくし、脊髄の右背側を吸引し始めます。脊髄の中間部および腹側部分へと切り進み、背側から腹側まで、また正中線から外側髄膜まで完全に貫通する長さ2 mmの空洞を作成します。HEMIセクションの病変空洞内に、生理食塩水に浸したゲルフォームを配置します。止血を行うため、あらかじめ採取しておいた末梢神経セグメントをHank液から取り出します。神経セグメントの近位3 mmの神経外膜を軽く触知し、この端をHEMI切断病変腔の吻側壁に合わせます。神経外膜から硬膜に向けて10-0縫合糸でセグメントを固定します。次に、移植片の端を覆うように硬膜を縫合し、移植片を2枚のセルエラスティック膜で挟み込みます。移植片をC6、C7およびT1の椎骨突起に沿って配置します。神経の遠位端を脊髄や筋肉組織に接触させないでください。4-0縫合糸を用いて筋肉を層状に縫合し、皮膚切開部は皮膚ステープラーで閉鎖します。最後に、動物をサーマルバリアの上に置いたホールドケージに入れ、その後ホームケージに戻します。動物が覚醒し活動的になると、PN移植片の遠位端に到達した再生軸索が脊髄へ戻って伸展できないことがよくあります。そのため、コンドロイチンACEを微量注入し、損傷部位周辺の瘢痕組織を分解させます。この手順はPN移植から21日後に実施します。まず、動物が完全に麻酔状態にあることを確認してください。次に、以前に示した方法で創傷クリップを取り除き、抗生物質および鎮痛剤を投与します。微細鑷子とスプリング鋏を用いて表在性の縫合糸を切断し、神経移植片を囲む弾性膜を露出させます。神経の長さを弾性膜から慎重に剥離します。神経を術野から避けて寄せます。第7頚椎椎弓の右側で部分的な椎弓切除術を行います。マイクロメスを用いて髄膜を穿刺し、吸引によってC7脊髄に1 mm³の背側四分の一病変腔を作成します。止血させるため、生理食塩水に浸したゲルフォームを病変腔に配置します。その後、ゲルフォームをコンドロイチン硫酸に浸したものと交換します。A BC。病変部位を15分間処置し、5分ごとにコンドロイチンを浸したゲルフォームを新しく交換する。神経移植片の外側をショラステック膜で覆う。浅層の筋肉を4-0縫合糸で、皮膚切開部を皮膚ステープラーで閉鎖する。動物をサーマルバリアの上に置いた保持ケージに入れ、覚醒して活動的になったらホームケージに戻します。その2日後、PN移植から23日後に、動物に再度手術を行い、脊髄にコンドロイチンNAを微量注入します。前回と同様に、麻酔をかけた動物から創傷クリップを取り除き、抗生物質および鎮痛剤を投与します。表在性の縫合糸を切断し、神経移植片を囲む弾性膜を露出させます。移植片を乱さないように注意しながら、C7の移植部位を露出させます。次に、先端を細く加工したガラスカニューレ付きのハミルトンシリンジを用いて、脊髄の右側、移植片と脊髄の接合部から遠位に約1 mmの点に、chondroitin ace A BCを1 µL微量注入します。神経セグメントの遠位2 mmからEURをそっと剥離し、この端をC7病変腔に対置させます。神経外膜を通して10-0縫合糸を用いて、セグメントを硬膜に固定します。浅層筋肉を4-0縫合糸で、皮膚切開部を皮膚ステープラーで閉鎖します。動物をサーマルバリア上の保持ケージに入れ、覚醒して活動的になったらホームケージに戻します。この手順が最適化されると、末梢神経節が宿主の脊髄と密接に統合され、移植片に再生する脊髄軸索を可視化できるようになります。私たちは、上行性および下行性の biotinylated dextrin amine (BDA) を用いて、移植片に拡散充填を行いました。脊髄軸索は通常、移植片に進入し、移植片の長手方向に対して比較的直線的に成長し、1日あたり約1mmの速度で移植片の遠位端まで伸展します。末梢神経軸索は隣接する脊髄に浸潤します。遠位端に到達した際に、周囲の瘢痕組織から抑制性プロテオグリカンを除去するためにコンドロイチンNACEが使用された場合、溶媒（vehicle）で処理したときとは異なり、処理後は末梢神経軸索が宿主組織へと伸展することはほとんどありません。しかしながら、遠位インターフェースをコンドロイチンで処理した場合、移植片から脊髄へと再神経支配を行う軸索が有意に多く伸展します。軸索伸展が観察される動物1匹あたり15〜20個の切片のうち、ここに示す1つの代表的な切片において、この棒グラフはconjoin nace A BC処理後に軸索伸展が有意に増加したことを示しています。移植片内の軸索への電気刺激に応答して、脊髄ニューロン上のシナプスマーカーを免疫化学的に検出することで、移植されたグラフトとホスト脊髄との間の機能的接続性を評価することができます。遠位接合部を含むこの脊髄領域を、ビオチン化デキストランアミン（緑色）およびシナプスマーカーであるsynapsin（赤色）で免疫細胞化学染色しました。矢印はマーカーの共局在領域を示しており、移植片から再生した一部の繊維が機能的なシナプス接合を形成したことを示しています。移植片と脊髄ニューロン間の機能的接続は、c-Fos発現のアッセイによっても実証されました。遠位インターフェースより先の宿主ニューロンにシナプス刺激を与えると、この経シナプス活性化マーカーにより、移植部位の同側組織に多くのc-Fos陽性ニューロンが確認され、高倍率で観察すると、移植部位の対側組織ではc-Fos陽性ニューロンがほとんど観察されませんでした。脊髄損傷後の再生を促進するために、末梢神経移植に向けた脊髄損傷部位の準備方法について説明しました。この処置を行う際は、移植前に十分な神経長を確保すること、および移植片を脊髄損傷部位に密接に接触させることが重要です。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

脚の動きと感覚を制御する無傷の右坐骨神経が露出している麻酔をかけたラットを取ります。神経セグメントを切除し、隙間を作り、神経軸索を切断し、信号伝達を妨害します。切断された遠位軸索は劣化し、特殊な神経修復細胞またはシュワン細胞が剥離します。マイクロチャネルを備えた柔らかいチューブであるバイオニック伝導神経足場を、切断された両端の神経外層である神経上膜に縫合します。神経終末近くに対の電極を埋め込み、皮膚の下のワイヤーを首の後ろに通します。継続的な電気刺激を加え、足場に穏やかなパルスを供給します。変性遠位端からのシュワン細胞は足場に移動し、マイクロチャネルに沿って整列します。これらの細胞は、近位端からの軸索の伸長を刺激する成長因子を放出します。軸索が伸びると、シュワン細胞は軸索を脂質が豊富なミエリン膜で包み込み、信号伝達を回復します。これは、神経修復のための足場と電気刺激の可能性を示しています。...

電気刺激と組み合わせたバイオニック導電性足場を使用した神経修復

出典: Zweckberger, K., et al.実験的頚髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗的利用 J. Vis. 経験。 (2015)。このプロトコルは、ラットモデルにおける脊髄損傷修復のための標的注射アプローチを示しています。これには、自己組織化ペプチド (SAP) を病変コアに送達して支持足場を作成し、その後病変の周囲に神経前駆細胞 (NPC)...

ラットモデルにおける脊髄修復のための自己組織化ペプチドと神経前駆細胞の注入

出典: Svientek, SR, et al.成体ラットにおける複合再生末梢神経界面(C‐RPNI)の作製 J. Vis.

神経損傷のラットモデルにおける複合再生末梢神経界面の構築

増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。...

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

自己組織化ペプチド（SAP）と神経前駆細胞）））の両方を用いて頚椎損傷を治療することは、再生と回復を促進するための有望なアプローチです。頸部SCIの挫傷/圧迫動脈瘤クリップラットモデルとSAP注射とNPC移植の併用治療が確立されています。...

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

重度の脊髄損傷はしばしば組織の欠陥を引き起こします。このようなギャップをうまく埋めて、急性損傷後および完全な脊髄離断術の 5 週間後に機械的マイクロコネクタ システムを移植することにより、ラットの組織適応、再生応答、および機能改善を促進するための 2...

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

この資料では、完全断裂後脊髄切り株とシュワン細胞 (SCs)...

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

以下の原稿は、複合再生性末梢神経界(C-RPNI)と呼ぶ生物学的、閉ループ神経フィードバックシステムを開発するための新しい方法を説明する。この構造は、末梢神経と統合して効率のよい運動信号を増幅すると同時に、感覚的フィードバックを提供する能力を有する。...

成体ラットにおける複合再生性末梢神経インタフェース(C-RPNI)の作製

この原稿は、筋腱板再生末梢神経インターフェース(MC-RPNI)と呼ばれる生物学的末梢神経インターフェースを開発するための革新的な方法を提供します。 この外科的構成物は、関連する末梢神経の運動遠心性信号を増幅して、運動意図の正確な検出と外骨格デバイスの潜在的な制御を容易にすることができます。...

無傷の末梢神経信号の増幅のための筋腱板再生末梢神経インターフェース

電気生理学的研究のための新生児マウス脊髄の分離のデモンストレーション。...

脊髄電気生理学

学ぶ末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせたラット脊髄損傷修復法。神経栄養因子と酵素を用いて再生を促進し、軸索再生と機能回復を評価する神経再生医学の手法です。

負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

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