Name: In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Lernen Sie die Elektroporation in utero und ex vivo zur Genexpression in retinalen Ganglienzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und axonalem Wachstum im visuellen System.

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Wir danken Dr. Richard Vallee und Brikha Shrestha für die Hilfe bei der in utero und ex vivo Retina Elektroporationstechniken bzw. und Dr. T. Sakurai für Kommentare zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants F31 NS051008 (TJP), der Fondation pour la Recherche Medicale, und das Human Frontier Science Program (AR) und R01 EY12736 (CM) unterstützt.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

In diesem Video haben wir Elektroporation Techniken, sowohl in utero und ex vivo, für den Gentransfer in embryonale murine RGCs demonstriert. In utero Netzhaut Elektroporation einen Mechanismus zur Manipulation der Genexpression in RGCs bietet und visualisieren ihre Axon Projektionen in vivo. Unter Berücksichtigung der Embryonen überleben postnatal ermöglicht Untersuchung dieser GFP + RGC Projektionen in ihrem Ziel, dem Corpus geniculatum laterale (LGN). Ex-vivo-Elektroporation Netzhaut sorgt für eine kontrollierte Möglichkeit, bestimmte Regionen der Netzhaut für die Verwendung mit In-vitro-Assays Ziel. Die Kombination in vivo und in vitro-Analysen mit diesen Techniken abgeleitet ermöglicht gründliche Charakterisierung von RGC Entwicklung und Axon Projektionen in einer Untergruppe von RGCs in einem ansonsten normalen Hintergrund. Während unserer Demonstration konzentriert sich auf die RGC Axon Guidance Chiasma, sowohl in utero und ex vivo Retina electroporations könnte für das Studium, wie Störungen in der Genexpression Wirkung RGC Differenzierung, dendritische Morphologie, elektrophysiologischen Eigenschaften, Synapsenbildung und ordnungsgemäße Kündigung in Zonen wie Targeting von Vorteil wie die LGN und Colliculus superior.

<table><tbody><tr><td>BTX Elektro Square Porator ECM 830 (mit Fußpedal)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Runde Pinzetten-Elektroden</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 oder CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Seiden-Nahtmaterial</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Mikropipetten mit Kolben</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12-Medium</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITS-Zusatzmittel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten mit Glasboden</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero und ex vivo elektroporation für die genexpression in maus retinalen ganglienzellen

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Die Netzhaut und ihr einziger Ausgangsneuron, die retinalen Ganglienzellen (RGC), umfassen ein hervorragendes Modell, in dem biologische Fragen wie Zelldifferenzierung, Axon Führung, Organisation und retinotopen Synapsenbildung [1] zu untersuchen, um. Ein Nachteil ist die Unfähigkeit, effizient und zuverlässig zu bearbeiten Genexpression in RGCs in vivo, vor allem in der sonst zugänglich murine Sehbahn. Transgene Mäuse können verwendet werden, um die Genexpression zu manipulieren, aber dieser Ansatz ist oft teuer, zeitaufwendig und kann unerwünschte Nebenwirkungen zu erzeugen. In chick, ist in ovo Elektroporation verwendet werden, um die Genexpression in RGCs für die Prüfung Netzhaut und RGC Entwicklung zu manipulieren. Obwohl ähnliche Elektroporationstechniken bei neugeborenen Maus Welpen entwickelt worden sind [2], erwachsenen Ratten [3], und embryonale murine retinae in vitro [4], erlauben keine dieser Strategien vollständige Charakterisierung des RGC Entwicklung und Axon Projektionen in vivo. Zu diesem Zweck haben wir zwei Anwendungen der Elektroporation, eine in utero und die anderen ex vivo entwickelt, um gezielt embryonale murine RGCs [5, 6]. Mit in utero Netzhaut Elektroporation, können wir misexpress oder herunterreguliert spezifische Gene in RGCs und folgen ihren Axon Projektionen durch die Sehbahn in vivo, sodass Prüfung von Leitlinien Entscheidungen auf Zwischenziele, wie das Chiasma oder auf Zielregionen, wie die Corpus geniculatum laterale. Störende Genexpression in einer Untergruppe von RGCs in einem ansonsten Wildtyp-Hintergrund ermöglicht ein Verständnis von Genfunktionen in der Netzhaut Weg. Darüber hinaus haben wir einen Begleiter Technik für die Analyse von RGC Axonwachstum in vitro entwickelt. Wir elektroporieren embryonalen Köpfe ex vivo, zu sammeln und inkubieren Sie die ganze Netzhaut, dann bereiten Sie Explantate aus diesen retinae einige Tage später. Retinal Explantate können in einer Vielzahl von in-vitro-Assays verwendet werden, um die Reaktion der Elektroporation RGC Axone in Führung Hinweise oder andere Faktoren zu untersuchen. In Summe ist, verstärkt diese Reihe von Techniken unsere Fähigkeit, misexpress oder herunterreguliert Gene in RGCs und sollte große Hilfe Studien, RGC Entwicklung und Axon Projektionen.

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Techniken zur Manipulation der Genexpression in murinen retinalen Ganglienzellen (RGC) durch<em&gt; In utero</em&gt; Und<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporation. Diese Techniken ermöglichen es, zu untersuchen, wie Veränderungen in der Genexpression RGC Entwicklung, Axon Führung und funktionellen Eigenschaften beeinflussen.

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

Die Retina und ihr einziges Output-Neuron, die retinale Ganglienzelle (RGC), stellen ein hervorragendes Modell dar, um biologische Fragestellungen wie die Zell...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Diese Studie beschreibt die Entwicklung...

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des...

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Lernen Sie die Elektroporation in utero und ex vivo zur Genexpression in retinalen Ganglienzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und axonalem Wachstum im visuellen System.

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

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