Name: Met behulp van de Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Leer elektrofysiologische technieken voor visieonderzoek met Limulus polyphemus. Deze methoden omvatten elektroretinografie, optische zenuwregistratie en intraretinale registratie voor inzicht in neurale mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Birgit Werner erkennen voor haar hulp bij het produceren van deze video artikel. Dit onderzoek werd gefinancierd door een NSF Career Award.

Deel 1: Experimentele Voorbereiding Experimentele procedures uitgevoerd op hoefijzer krabben zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Boston University. Dieren zijn gekocht van de Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) of een andere leverancier en gehuisvest in een beluchte zoutwater tank in een ruimte blootgesteld aan een gereglementeerde licht-donker cyclus. De verlichting regime is van belang voor entraining van de krab circadiane klok en fietsen in het oog dagelijks tussen de dag en nacht staten. Onmiddellijk voor aanvang van alle invasieve procedures, is het dier gekoeld in een ijsemmer gedurende 10-15 minuten totdat de beweging wordt afgeremd en vervolgens aan een houten platform met twee roestvrij stalen schroeven ingebracht in de prosoma en twee in de opisthosoma. Het platform is onder verzwaard met graniet, zodat het zinkt in water. Na terminal experimenten het dier wordt gedood door onderdompeling in ijs slurry weer en pithing de hersenen, die ligt boven de mond, met een scalpel. Deel 2: Oplossingen Limulus Ringer-oplossing bestaat uit 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES, en 10 ml / L Pen-Strep mix (penicilline-streptomycine, 10.000 eenheden / ml) . Deel 3: electrogram opnemen Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, vaseline, Ringer&#39;s oplossing, een transfer pipet, een groene LED, een opname kamer, roestvrij stalen schroeven, en een wattenstaafje. <ol><li> Een handgemaakte kamer wordt gebruikt om de ERG (Figuur 1A) vast te leggen. De kamer lichaam is ontworpen om een ​​zoutoplossing reservoir te houden in contact met de ogen. Het deksel bevat een zilverchloride draad voor het koppelen van de geleidende oplossing voor een versterker en een klein gaatje formaat om een ​​LED tegemoet te komen. Een Ultrabright LED met een piek rond 520nm-uitstoot het beste werkt. </li><li> Om te beginnen, is de onderkant van de kamer bedekt met vaseline en vastgezet over het oog met twee schroeven. </li><li> De kamer wordt vervolgens gevuld met zoutoplossing en afgedekt met het deksel. </li><li> Na de kamer bevestiging van de krab wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen. </li><li> De LED-kabel is aangesloten op de kamer deksel. </li><li> Het signaal wordt afgekapt leiden tot het chloride draad, en de referentie-lood wordt afgekapt tot een van de geïmplanteerde schroeven. </li><li> Beide leads zijn aangesloten op het hoofd podium van een hoge impedantie differentiële versterker (X-cell 3x4, FHC Inc) voor signaalversterking en de versterker filter is ingesteld om de frequenties te gaan onder de 10Hz. </li><li> De versterker uitgang wordt gevoed aan een oscilloscoop voor het bekijken en om een ​​data-acquisitie board voor computer-analyse en opslag. </li><li> Na de installatie van de kooi deur gesloten is om ruimte te licht te blokkeren van het bereiken van het dier. </li><li> De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in LabVIEW. Het programma knippert de LED, registreert de opgeroepen ERG-signaal, en meet de piek-piek amplitude response. De keuze van de flash paradigma hangt af van de experimentele doelstelling. Bijvoorbeeld, een korte (100ms) pols van 5V toegepaste elke 10 minuten naar de LED voorkomt effecten van licht adaptatie bij de monitoring van circadiane veranderingen in het oog gevoeligheid. </li></ol> Deel 4: Optische zenuw-opname Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, draad, een trephine, Ringer&#39;s oplossing, rongeurs, vannas schaar, een opname kamer, gebogen tang, fijne naald probes, een doffe scalpel, chirurgische scharen, en een zuig-elektrode. <ol><li> Een handgemaakte kamer wordt gebruikt om de oogzenuw reacties (Figuur 1B) record. Het interieur van de kamer is 2 cm diameter openen goed dat een dunne sleuf halfronde opening in de bodem muur om de zenuw huisvesten en te isoleren uit het omringende weefsel is. </li><li> Voordat kamer bevestiging een 16-gauge naald wordt ingevoegd tussen het scharnier spieren in het hart en ~ 20CC van bloed wordt afgetapt van het dier. Verbloeding is niet noodzakelijk maar maakt oogzenuw dissectie gemakkelijker. </li><li> De locatie van de oogzenuw wordt geschat door te putten uit het schild een licht gebogen lijn tussen de laterale en mediane ogen. </li><li> Een ronde gat wordt vervolgens gesneden in het schild met een trephine. Het gat is dezelfde diameter heeft als de kamer ook. Het centrum van het gat bevindt zich 2-3 cm anterieur van de laterale oog en iets dorsaal van de lijn, zodat de zenuw loopt langs de ventrale deel van de put. </li><li> Bindweefsel is gewist totdat de zenuw is volledig zichtbaar en vrij van de omringende en onderliggende weefsel. </li><li> Een streng van de draad is een lus rond de zenuw en trok in de kamer door de sleuf aan de onderkant. Door deze zelfde openen van de zenuw wordt voorzichtig geleid in de kamer door te trekken aan het touw. Tegelijkertijd is de kamer goed is in het gat. De kamer wordt dan aangebracht op het schildmet schroeven en de put is gevuld met Ringer&#39;s. </li><li> Na de kamer bevestiging van het dier wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen. </li><li> Het goed wordt gevisualiseerd in een stereoscoop (SMZ-168, Jed Pella Inc) en katoen is gevoerd rond de opening in de bodem om lekkage van bloed te voorkomen in en zout uit de kamer. </li><li> Residuele bindweefsel rond de zenuw wordt verwijderd met een fijne schaar en pincet, en de kamer is gevuld met de oplossing verse Ringer&#39;s. </li><li> Een nick is gemaakt in het bloedvat dat de zenuw omhult en door deze opening de zenuw wordt zorgvuldig desheathed in de lengte met behulp van fijne schaar, pincet, naald en sondes. </li><li> Een klein vezelbundel is gescheiden van de zenuw met behulp van de sonde en snijd aan het eind het verst van het oog voor afferente vezels opnemen en aan het einde het dichtst bij het oog voor efferente vezels opnemen. In de video het einde voor afferente vezel-opnames is te snijden. </li><li> Een microsuction elektrode (AM Systems Inc) gevuld met Ringers oplossing wordt gebruikt voor optische zenuw opname. De elektrode tip is gemonteerd op de zenuw bundel door het vuur het polijsten van het einde van een 1 mm diameter borosilicaatglas capillair. </li><li> De elektrode tip is neergelaten in de kamer goed met een handmatige manipulator (WPI Inc), en de snede vezelbundel wordt meegezogen in de tip. Afzuiging wordt verzorgd door een Gilmont spuit is aangesloten op de elektrode via de slang. </li><li> Een BNC-aansluiting geeft de signaal lood en een zilverchloride draad gewikkeld rond de elektrode om ruis te verminderen geeft de referentie te leiden. De twee leads zijn aangesloten op het hoofd podium van een differentiële versterker voor signaalversterking en geluid filtering (X-cell 3x4, FHC Inc). De versterker uitgang wordt gestuurd naar een oscilloscoop voor het bekijken en een data-acquisitie kaart voor de computer analyse en opslag. </li><li> De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in LabVIEW. Het programma controleert lichtprikkels via een digitale video-processor (bits + +, Cambridge Research Systems Inc) en interfaces met een digitale spike discriminator (APM, FHC Inc), die spike treinen records. Licht kan worden geleverd aan enkele cellen in het oog via een glasvezel licht buis of op het gehele oog via een computer-gestuurde video weer te geven. </li></ol> Deel 5: Intraretinal opname Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, een L-vormige Lucite platform met schroefdraad schroefgaten, een micro-elektrode houder met een glazen pipet, roestvrij stalen schroeven, pincet, scalpel en een boete. <ol><li> Een handgemaakte Lucite plaat met vooraf ingestelde schroefgaten wordt gebruikt om de intracellulaire responsen op te nemen. De gaten zijn verdeeld voor het monteren van een gemotoriseerde micromanipulator (PPM5000, WPI Inc). De plaat is aan het dier bevestigd met twee schroeven aan de zijkant en een op de top. </li><li> Na de plaat bevestiging van het dier wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen. </li><li> De micropositioner is geschroefd in de plaat, met zijn beweegbare arm uitgelijnd over het oog. </li><li> Een partij van glas micropipetten worden getrokken van 1-mm OD borosilicaat glas en de tips zijn opgevuld via capillaire werking door het plaatsen van de micropipetten in een klein flesje van 3M KCl oplossing. </li><li> De rest van de pipetten zijn vervolgens handmatig gevuld met de zoutoplossing en ingebracht in een electrode houder. </li><li> De elektrode houder is verbonden met de hoofd fase van een intracellulaire versterker (IR-283, Cygnus Technology Inc) aangebracht op het micropositioner arm. </li><li> Een klein deel van de retina (~ 1mm2) wordt blootgesteld door het wegsnijden van de cornea-interface met een scheermesje. </li><li> Een druppel van de oplossing Ringer is geplaatst op de blootgestelde netvlies te drogen te voorkomen en de micropipet tip is gevorderd door de opening in retinaal weefsel. </li><li> Wanneer de tip van de oplossing komt, wordt de huidige injectie modus van de intracellulaire versterker ingeschakeld en elektrode impedantie is gemeten. Micropipetten met een impedantie buiten het bereik van 20-70 MW worden verwijderd. Die in dit assortiment zijn gevorderd in micron stappen en gespietst in de cellen door het vibreren van de pipetpunt elektronisch of mechanisch. </li><li> Drie typen cellen kunnen worden aangetroffen in het oog. Retinular cellen laten slechts een depolariserende reactie op licht, excentrieke cellen vertonen een trein van actiepotentialen rijden op een depolariserende respons, en pigment cellen vertonen geen licht reactie. </li><li> De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in Labview. Het programma controleert lichtprikkels via een digitale video-processor (bits + +, Cambridge Research Systems). De stimuli worden geleverd aan gespietst cellen met een glasvezel pijp of beeldscherm. Spanning reacties worden waargenomen op de oscilloscoop en gedigitaliseerd door het programma naar de computer. </li></ol> Deel 6: representatieve resultaten Een vertegenwoordiger ERG is weergegeven in figuur 2A. De golfvorm geeft de opgetelde elektrischereactie op licht van vooral de photoreceptive retinular cellen, zijn zij zeer talrijker zijn dan de excentrieke cellen en elektrisch gekoppeld. Er zijn niet meerdere golfvorm componenten van verschillende celtypes het netvlies als bij de zoogdieren ERG. Circadiane feedback van een klok in de hersenen Limulus moduleert de fysiologische eigenschappen van het netvlies cellen op een dagelijkse basis, waardoor de amplitude en tijdsverloop van de ERG te variëren in de tijd (1). Zoals getoond in Figuur 2B, ERG amplitude is het hoogst tijdens de subjectieve van het dier &#39;s nachts en het laagst tijdens de subjectieve dag. Een vertegenwoordiger spoor van een enkele optische zenuwvezel reactie op licht is weergegeven in figuur 3. Excentrieke cellen gedragen zich al ongeveer hetzelfde, met een tijdelijke verhoging van de piek debiet, gevolgd door een verval naar een constant hoog niveau. Het tarief verval weerspiegelt de gecombineerde werking van het licht aanpassing en spike-afhankelijke self-remming op excentrieke cellen (2). Andere spike patronen, zoals licht-afhankelijke afname van de snelheid, zijn gezien in de Limulus hersenen, maar niet in het oog (3). Representatief zijn sporen van de spanning reactie van een pigment cel, retinular cel en excentrieke cel aan het licht zijn weergegeven in figuur 4. Alleen de laatste twee netvlies celtypen zijn visueel. De amplitude en de tijd loop van hun reactie hangt af van de kwaliteit van de opname en de locatie van de elektrode in de cel. Meestal is de elektrode dringt pigment cellen of retinular cellen vanwege hun grote omvang en aantal. In het laatste geval een tijdelijke depolarisatie dat vervalt tot een constant hoog niveau is opgenomen. Het verval is te wijten aan het licht adaptatie door retinular cellen (2). Als de elektrode komt een excentriek cel, zijn grote actiepotentialen geregistreerd in het axon (40-70mV) en kleine actiepotentialen rijden op een depolariserende golfvorm (&lt;25mV) bij de soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Schematische diagrammen van kamers gebruikt voor electroretinogram opname (A) en de optische zenuw-opname (B). Bar is gelijk aan 7mm in A en 5mm in B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Voorbeeld spoor van een Limulus ERG opgeroepen door een LED-100ms puls van 5V in het donker (A) en de piek-piek fluctuatie in ERG amplitude loop van de tijd in constante duisternis (B). Duisternis is een initiatief op dat moment aangegeven door de witte driehoek. De groei van de ERG amplitude door de tijd aangegeven door de zwarte driehoek is te wijten aan het licht aanpassing, die gevoelige ogen toeneemt in het donker. De cyclische variatie in ERG amplitude is daarna door interne het dier circadiane klok. Tijdstippen in B zijn elke 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figuur 3" /> Figuur 3. Voorbeeld spoor van een oogzenuw vezel reactie op licht flitste op een enkele ommatidial receptor. Golfvorm boven het trace laat zien stimulus timing. Excentriek cellen, waarvan axonen aanleiding geven tot zenuwvezels, alle tonen een vergelijkbaar patroon van stoken, omdat dit onder de verlichting voorwaarden van het experiment (5sec flash in totale duisternis). Retinale codering met spikes is een eigenschap Limulus gemeen heeft met de zoogdieren, in tegenstelling tot andere ongewervelden. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figuur 4" /> Figuur 4 Voorbeeld sporen van de spanning reactie op licht van de drie soorten cellen aanwezig zijn in de Limulus laterale oog:. Pigment cellen (A), retinular cel (B), en de excentrieke cel (C). De eerste cel is niet-visuele. De laatste twee depolariseren op een lichtflits. De depolarisatie is het grootst voor retinular cellen, omdat ze transduceren het licht en stuurt het signaal via gap junctions de excentrieke cel, met enig verlies langs de weg. In de excentrieke cel worden actiepotentialen afgevuurd door de axon zien rijden op de depolarisatie te wijten aan spike backpropagation in de soma. De amplitude van actiepotentialen is afgezwakt in de figuur voor een betere weergave van de depolariserende potentieel. De rustpotentiaal van de cellen is-50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

We hebben geïllustreerd hoe ERG opnames, oogzenuw opnamen en intraretinal opnamen op hoefijzer krabben in vivo uit te voeren. De opname technieken die elk bieden verschillende inzichten in de neurale basis van visie, en ze kunnen allemaal worden gebruikt om de functie van de retina in levende dieren, dankzij de grote van de krab in de ogen en de harde rugschild te bestuderen. Oogzenuw activiteit kan zelfs worden opgenomen van vrij gedragen dieren in de oceaan met de juiste constructie van de elektroden (4). Deze technie...

<table><tbody><tr><td>LED</td><td>Lichtbron</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>Zuigelektrode</td><td>Elektrode</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>XCell 3*4-kanaals extracellulaire versterker</td><td>Versterker</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>Intracellulaire registratie</td><td>Versterker</td><td>Cygnus</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>Neurale spike-discriminator</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Videobord</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>Piezopatch-manipulator</td><td>Micropositioneer</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>Vierkantpulsstimulator</td><td>Zenuwstimulator</td><td>Grastechnologieën</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Micropipetpuller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglazen capillair</td><td>Elektrodegas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Paarden&amp;#8211; krab&lt;Elektronenmicroscopie&gt;Limulus polyphemus&lt;/em&gt;)</td><td>Dier</td><td>Marine Biological Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettrekker</td><td>Glastrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Zoom-stereomicroscoop</td><td>Microscoop</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van de horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

De Amerikaanse degenkrab, Limulus Polyphemus is een van de oudste wezens op aarde, en het dier blijft spelen een onmisbare rol in biomedisch onderzoek. Niet alleen hun bloed bevat speciale cellen die wetenschappers gebruiken om bacteriotoxins op te sporen in onze geneesmiddelen, maar hun ogen bevatten ook een neuraal netwerk dat heeft veel inzicht over de fysiologische processen die actief zijn in ons visuele systeem, zoals licht aanpassing en laterale inhibitie. De degenkrab blijft een aantrekkelijk model voor de visie onderzoek, omdat het dier is groot en winterharde voor een ongewerveld, zijn netvlies neuronen zijn groot en gemakkelijk bereikbaar, het visuele systeem is compact en uitgebreid bestudeerd, en de visuele gedrag is goed gedefinieerd. Bovendien is de structuur en functie van de ogen worden gemoduleerd op een dagelijkse basis door een circadiane klok in de hersenen van het dier is. In het kort, het visuele systeem van de hoefijzer krabben is eenvoudig genoeg is om nog te begrijpen complex genoeg om interessant zijn. In deze video geven we drie elektrofysiologische paradigma&#39;s voor het onderzoek naar de neurale basis van de visie dat kan in vivo worden uitgevoerd met Limulus. Ze zijn electrogram opname, oogzenuw opnemen en intraretinal opname. Electroretinogram (ERG) opnames te meten met een oppervlakte elektrode de opgetelde elektrische respons van alle cellen in het oog met een flits van licht. Ze kunnen worden gebruikt om de algemene gevoeligheid van het oog voor de verlenging van tijd te controleren. Oogzenuw opnames meten de stekelige activiteit van enkele zenuw vezels met een extracellulair microsuction elektrode. Ze kunnen worden gebruikt om visuele boodschappen van het oog naar de hersenen als circadiane klok berichten teruggekoppeld van de hersenen naar de ogen te bestuderen. Intraretinal opnames meten met een intracellulaire micro-elektrode de spanningsschommelingen veroorzaakt door het licht in de individuele cellen van het oog. Ze kunnen worden gebruikt om cellulaire mechanismen van het netvlies verwerking toe te lichten.

In deze video voeren we electrogram opname, oogzenuw opnemen en intraretinal opnemen met de Amerikaanse hoefijzer krab,<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Deze elektrofysiologische paradigma&#39;s kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de neurale basis van de visie in een onderzoek of onderwijs lab.

Met behulp van de Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

De Amerikaanse hoefijzenkrab, Limulus polyphemus, is een van de oudste wezens op aarde en het dier blijft een onmisbare rol spelen in ...

Hallo, ik ben Chris Paglia, directeur van het Visual Information Processing Lab hier bij de afdeling Biomedical Engineering aan de Boston University. Hallo, ik ben Jacque Liu, promovendus in het lab van Dr. Paglia. De onderzoeksactiviteiten van ons lab zijn gericht op het begrijpen van de neurale berekeningen die dieren in staat stellen om te zien.Voor dit onderzoek maken we gebruik van een van de oudste wezens op aarde, de Amerikaanse hoefkrab. Hoewel deze dieren als levende fossielen worden beschouwd, blijven ze een onmisbare rol spelen in het biomedisch onderzoek.Niet alleen bevat hun bloed speciale cellen die wetenschappers gebruiken om bacteriële toxinen in onze medicijnen te detecteren, maar hun ogen bevatten ook een neuraal netwerk dat veel inzicht heeft verschaft in de werking van ons visuele systeem. De cellulaire basis van processen zoals lichtadaptatie en laterale inhibitie werd voor het eerst onthuld in studies naar de samengestelde zijenoog van het dier, en voor dit baanbrekende werk ontving Dr. Keffer Hartline in 1967 een Nobelprijs. De pijlschildpad blijft een aantrekkelijk model voor visieonderzoek omdat het dier groot en robuust is voor een ongewervelde, en zijn retina-neuronen groot en gemakkelijk toegankelijk zijn.Het visuele systeem is compact en uitgebreid bestudeerd, en het visuele gedrag is goed gedefinieerd. Bovendien worden de structuur en functie van de ogen dagelijks gemoduleerd door een circadiane klok in de hersenen van het dier. Kortom, het visuele systeem van hoefkrabben is eenvoudig genoeg om te begrijpen, maar complex genoeg om interessant te zijn.In deze video illustreren we drie experimentele paradigma's voor het onderzoeken van de neurologische basis van het gezichtsvermogen die in vivo kunnen worden uitgevoerd met dit klassieke diermodel. Voor visueel onderzoek zijn dit het registreren van het elektroretinogram, het registreren van de oogzenuw en intraretinale registratie. De hoefkrabben worden gehouden in een beluchte zoutwatertank in een ruimte die is blootgesteld aan een gereguleerde licht-donkercyclus.Voordat men begint met een van deze registratietechnieken, worden de dieren ongeveer 10 minuten gekoeld in een ijsemmer en vervolgens vastgezet op een houten platform door twee roestvrijstalen schroeven in het prosoma en twee in het opisthosoma te plaatsen. Het platform is aan de onderzijde verzwaard met graniet zodat het in het water zinkt. Het elektroretinogram of ERG wordt gebruikt om de ooggevoeligheid in de loop van de tijd te bewaken.Het meet de totale elektrische respons van alle cellen in het oog. Voor de lichtflits-methode zijn de volgende instrumenten nodig voor deze procedure: een schroevendraaier, vaseline, ringersoplossing, een pipet, een LED, een registratiekamer, roestvrijstalen schroeven en een wattenstaafje. We gebruiken een zelfgebouwde registratiekamer om het ERG te meten.De behuizing is ontworpen om een reservoir met zoutoplossing in contact met het oog te houden. Het deksel bevat een zilverchloride-draad voor de koppeling van de geleidende oplossing aan een versterker en een klein gat met een afmeting die geschikt is voor een LED vóór de bevestiging. De onderzijde van de kamer is bekleed met vaseline.De kamers worden vervolgens met twee schroeven over het oog van de hoefkrab vastgezet, gevuld met zoutoplossing en afgesloten. Het dier wordt in een lichtdichte kooi in een tank geplaatst, gevuld met zeewater tot boven de kieuwen. De LED-kabel wordt in het deksel van de kamer gestoken.De signaalleiding wordt vastgezet aan de kamerdraad en de referentieleiding aan een van de geïmplanteerde schroeven, waarna beide leidingen worden aangesloten op de headstage van een differentiaalversterker met hoge impedantie voor signaalversterking en ruisfiltering. De kooi wordt vervolgens gesloten om te voorkomen dat kamerlicht het dier bereikt. De ad-stage wordt aangesloten op de versterker en de filters van de versterker worden ingesteld om frequenties onder ongeveer 10 hertz door te laten.Vanaf daar gaat het signaal naar een oscilloscoop voor visualisatie en naar een data-acquisitiekaart voor computeranalyse en opslag; we gebruiken een op maat gemaakt programma geschreven in LabVIEW om lichtstimuli via de LED toe te dienen en het ERG-signaal te registreren. De LED wordt elke 10 minuten geactiveerd met een puls van 100 milliseconden van 5 V. Links wordt de ERG-golfvorm van elke lichtflits weergegeven, en rechts is de piek-tot-piekamplitude van opeenvolgende flitsgolfvormen uitgezet om veranderingen in de ooggevoeligheid in de loop van de tijd te volgen.Met ERG-registraties kan men de effecten van lichtadaptatie en circadiane neurale modulatie bestuderen. Het oog geleidt visuele signalen naar de hersenen via de spike-responsen van de vezels van de oogzenuw. De gecodeerde signalen kunnen worden bestudeerd door extracellulair te registreren vanuit individuele zenuwvezels.Circadiane kloksignalen die teruggekoppeld worden naar het oog kunnen ook met deze methode worden bestudeerd. De benodigdheden voor deze procedure omvatten een schroevendraaier, een ringoplossing, scharen, een registratiekamer, gebogen pincetten, een fijne naaldsonde, een stomp scalpel, chirurgische scharen en een sectie-elektrode. De registratiekamers zijn ontworpen met een lip om de zenuw te accommoderen; 20 milliliters bloed kan uit het paard worden gedraineerd door een naald van 16 gauge tussen de scharnierspieren en naar het hart in te brengen.Exsanguinatie is niet noodzakelijk, maar maakt de dissectie van de oogzenuw eenvoudiger wanneer het dier aan het platform is bevestigd. De locatie van de oogzenuw wordt geschat door een licht gebogen lijn op het carpus te trekken tussen de laterale en mediale ogen. Vervolgens wordt met een refin een cirkelvormig gat in het carpus gemaakt.Het gat heeft dezelfde diameter als de bodem van de kamer. Het middelpunt van het gat bevindt zich ongeveer twee centimeter anterieur van het laterale oog en iets dorsaal van de lijn, zodat de zenuw langs het ventrale gedeelte van de kamer loopt; het bovenliggende bindweefsel wordt verwijderd totdat de volledige lengte van de zenuw zichtbaar is en de blootgelegde zenuw wordt bevrijd van het omliggende en onderliggende weefsel. Een draad wordt om de zenuw geslagen en door de halfronde opening in de bodem de kamer in getrokken.Via dezelfde opening wordt de zenuw voorzichtig in de kamer geleid door aan het draadje te trekken. Terwijl de zenuw de kamer binnentreedt, wordt de bodem in het gat geduwd om de rek op de zenuw te minimaliseren. De kamer wordt vervolgens met twee schroeven bevestigd en gevuld met Ringer-oplossing.Na bevestiging van de kamer wordt het dier in een kooi met een lichte getijdenstroom geplaatst in een tank gevuld met zeewater tot over de kieuwen. De binnenzijde van de kamer wordt gevisualiseerd onder een stereoscoop en rond de opening van de bodem wordt watten aangebracht om lekkage van bloed in de kamer en van Ringer-oplossing uit de kamer te voorkomen. De kamer wordt opnieuw gevuld met verse Ringer-oplossing.Residuen van weefsel worden verwijderd met fijne scharen en pincetten. Er wordt een kleine incisie gemaakt in de schede die de zenuw omhult, waarna de zenuw met een fijne naaldsonde van de schede wordt gescheiden. De schede wordt geleidelijk afgewikkeld en verwijderd door langs de lengte van de zenuw te knippen.Vervolgens wordt een klein vezelbundeltje met de probe van de zenuw gescheiden en wordt deze aan het uiteinde dat het verst van het oog afligt doorgesneden voor de registratie van afferente vezels, en aan het uiteinde dat het dichtst bij het oog ligt voor de registratie van efferente vezels. Voor de registratie gebruiken we een AM-systeem sectie-elektrode gevuld met Springer-oplossing, die via slangetjes is verbonden met een Gilman-spuit voor zuiging. De elektrodepunt wordt gemaakt door het uiteinde van een borosilicaatglazen capillair met een diameter van 1 mm vuur te polijsten. Een B- en C-verbinding zorgt voor de signaalleiding, en de referentieleiding is een zilverchloride-draad die om de elektrode is gewikkeld om ruis te verminderen.De elektrodepunt wordt in de registratiekamer geplaatst en het afgesneden uiteinde van het zenuwbundel wordt via zuiging in de glazen punt getrokken. De signaal- en referentieleidingen worden aangesloten op de head stage van een differentiële versterker voor signaalversterking en ruisfiltering. De uitgang van de versterker wordt doorgegeven aan een oscilloscoop voor visualisatie en aan een data-acquisitiekaart voor computeranalyse en opslag.We gebruiken een op maat gemaakt programma geschreven in LabVIEW om lichtstimuli aan te sturen en een digitale spike-discriminator om spike-treinen te registreren. Voor de belichting van individuele cellen wordt een glasvezel lichtgeleider gebruikt, terwijl voor patroonstimulatie met registraties van de oogzenuw een computergestuurd videoscherm wordt ingezet; hiermee kan de signaaloverdracht tussen de ogen en de hersenen intraretinaal worden bestudeerd. De registratie omvat het direct inbrengen van een micro-elektrode in cellen in het oog en het registreren van de door licht geïnduceerde intracellulaire spanningsschommelingen.De benodigde hulpmiddelen voor deze procedure zijn een schroevendraaier, een L-vormig transparant platform. De geschroefde schroefgaten een micro-elektrode over de glaselektrode, roestvrijstalen schroeven, een pincet en een fijn scalpel. Na het fixeren van de krab, een stevige boom, een houten platform, wordt een transparante plaat met vooraf ingestelde schroefgaten aan de carpus bevestigd met twee schroeven aan de zijkant en één aan de bovenkant.Het dier wordt in een lichtdichte kooi geplaatst in een tank gevuld met zeewater boven de kieuwen. Een gemotoriseerde micro-positioneerder wordt met schroeven aan de plaat bevestigd en de arm van de positioneerder wordt boven het oog uitgelijnd. Een reeks glazen micropipetten wordt getrokken uit silicaatglas met een buitendiameter van 1 mm, en de punten worden door capillaire werking gevuld.Door de pipetten enkele minuten in een vial met een drie molaire kaliumchloride-oplossing te plaatsen, wordt de rest van de pipet handmatig gevuld met de zoutoplossing en vervolgens ingebracht in een micro-elektrodehouder die vooraf met oplossing is gevuld om belvorming te voorkomen. De elektrodehouder wordt vervolgens in de head stage van een intracellulaire versterker geplaatst die aan de micro-positioneerder is bevestigd. Een deel van het netvlies wordt blootgelegd door voorzichtig een klein vierkant gedeelte van het dorsale hoornvlies weg te snijden.Met het scalpel wordt een druppel Ringer-oplossing op het blootgestelde weefsel aangebracht om uitdroging te voorkomen, waarna de micropipet richting het netvlies wordt bewogen. Zodra de punt van de pipet de oplossing raakt, wordt de huidige injectiemodus van de intracellulaire versterker geactiveerd en wordt de impedantie van de elektrode gemeten; micropipetten met impedanties buiten het bereik van 20 tot 70 mega ohm worden weggegooid. De pipetten die binnen dit bereik vallen, worden in stappen van micrometers grootte in het netvlies bewogen en in cellen gepenetreerd door de punt elektronisch te laten vibreren; lichtstimuli worden toegediend via een glasvezelbuis of videoscherm om cellen te penetreren.In het oog van de hoefkrab kunnen drie typen cellen worden aangetroffen: ularcellen, excentrische cellen en pigmentcellen. Ularcellen vertonen een grote depolariserende respons op licht, excentrische cellen vertonen een reeks actiepotentialen op een depolariserende respons, en pigmentcellen vertonen helemaal geen respons op licht. De respons wordt waargenomen op een oscilloscoop en vastgelegd op een computer met intraretinale registraties. Hiermee kan de cellulaire basis van het gezichtsvermogen worden bestudeerd.Tot slot hebben we aangetoond hoe elektroretinogram-registraties, oogzenuwregistraties en intraretinale registraties in vivo bij hoefkrabben kunnen worden uitgevoerd. Deze methoden worden op grote schaal gebruikt en bieden unieke inzichten in de neurale mechanismen van de verwerking van visuele informatie bij hoefkrabben. Ze zijn niet alleen eenvoudig toe te passen in een onderzoekslaboratorium, maar kunnen ook gemakkelijk worden geïntegreerd in een onderwijslaboratorium voor visuele neurofysiologie.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Amerikaanse degenkrab, Limulus polyphemus, is misschien wel de meest handige bron voor grote hoeveelheden bloed van een ongewervelde. Het bloed is eenvoudig in samenstelling, met slechts een cel-type in de algemene circulatie, de granulaire Amebocyte, en slechts drie overvloedige eiwitten in het plasma, hemocyanine, de C-reactieve proteïnen en α2-macroglobuline. Bloed wordt verzameld vanuit het hart en het bloed cellen en plasma worden gescheiden door centrifugeren.

Bloedafname van de Amerikaanse Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.

Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering

This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.

Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulaire Recordings

Een protocol voor de studie van desensibilisatie en gevoeligheid herstel van rivierkreeft fotoreceptoren als een functie van de circadiane tijd wordt gepresenteerd.

Desensibilisatie en herstel van de kleurplaatjes bij de afgifte van een licht stimulus

Om de muis visie te onderzoeken, hebben we een dreigende test uitgevoerd. Muizen werden geplaatst in een grote vierkante Arena met een monitor op het plafond. De dreigende visuele stimulus riep constant het bevriezen of vlucht reacties in de muizen op.

Met behulp van dreigende visuele prikkels om de muis visie te evalueren

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Twee eyestalk ablatieprotocollen (d.w.z. cauterisatie en chirurgische benaderingen) werden uitgevoerd op verdoofde vrouwelijke krabben. De oogsteblablatie van modderkrabben versnelde de rijping van eierstokken zonder de overlevingskans te verminderen.

Eyestalk ablatie om de ovariële rijping bij modderkrabben te verhogen

Leer elektrofysiologische technieken voor visieonderzoek met Limulus polyphemus. Deze methoden omvatten elektroretinografie, optische zenuwregistratie en intraretinale registratie voor inzicht in neurale mechanismen.

Met behulp van de Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

Meer video's verkennen