小动物的肌肉植入动态跟踪在体内荧光成像

大家好，我是来自波士顿伯格姆妇女医院麻醉科的 Juwan 马。今天，我们将向您展示一种获取体内荧光图像以监测小鼠肌肉再生进度的技术。我们在实验室中使用该程序来研究移植的肌肉干细胞的植入。

那么让我们开始吧。从 GFP 转基因小鼠中分离和培养用于移植的 GFP 标记的细胞在继续之前，捏脚趾确认小鼠已完全麻醉。然后去除后腿肌肉 在无菌条件下，然后将肌肉浸渍。

通过将碎肉与 2% dis 显示胶原酶溶液在 37 摄氏度下孵育 1 小时来解离卫星细胞。孵育后，加入含有火腿 F 10 和 20% FBS 的生长培养基以停止酶消化。然后，肌肉通过与意大利面 perpe 的重复 tri rating 分离。

接下来，细胞通过细胞过滤器过滤，然后接种到未包被的培养皿上。将培养皿置于标准细胞培养箱中 1 小时。为了将卫星细胞与具有更强粘附特性的其他细胞群分离，将上清液倒入涂有胶原蛋白的培养皿上，再孵育一小时。

孵育后，再次去除所得富含卫星细胞的螺旋体，并将其应用于新的胶原蛋白包被板并培养，直到观察到成肌细胞集落。这个过程称为 prepl 细胞在达到 60% 至 70% 细胞汇合时传代。一小部分细胞用于免疫细胞化学，用产肌细胞标志物染色以验证培养物中肌肉细胞的纯度。

一旦确认了肌原细胞的纯度，细胞就会在同一培养物中扩增。细胞移植前的移植条件用 N 0.25% 胰蛋白酶分离。将 EDTA 细胞洗涤两次，并以 5 倍 10 的浓度重悬于 HBSS 中，至每毫升 7 个细胞，每个胫骨、前肌或 TA 肌注射 10 微升细胞溶液。

对于体内成像，首先将 GFP 标记的成肌细胞移植到 4 至 6 周龄的雄性小鼠中。用氯胺酮甲苯噻嗪麻醉小鼠，并在确认麻醉状态后启动该程序。为了减少背景噪音，通过在腿上涂抹 nare 并等待 30 秒后再擦掉后，去除两条后腿上的毛发。

对于棉签涂抹器，然后用浸泡在蒸馏水中的新棉签涂抹器再次擦拭腿部，以去除残留的棉签和毛发，将细胞移植到小鼠体内。首先将 10 微升 HBSS 中的 5 乘以 10 吸入 5 个细胞中，放入 Hamilton 注射器中。用 30 号针头，沿 TA 肌的长轴、上内侧和下部将等量的细胞注射到三个位置。

每次注射后，握住针头两分钟，然后再将其从肌肉中抽出，以防止针头沿线泄漏。拖曳。在等待期间，将等量的细胞抽入另一个注射器中，以同样的方式注射对侧 TA 肌肉细胞注射后，立即将鼠标以俯卧位放在一张黑色非荧光纸上，将双脚固定在纸上，跖下，双腿分开 90 度。然后将小鼠放入夜猫子 LB 9 81 荧光成像站的腔室中。

配备高灵敏度电荷耦合相机，一条后腿位于相机视野的中心。首先，拍摄腿部的传统灰度摄影照片。要开始成像，请选择具有特定波长的绿色荧光蛋白的适当发射滤光片。

拍摄一张曝光时间为 1， 250 毫秒的图像，然后拍摄另一张曝光时间为 500 毫秒的图像。我们发现，较长的曝光时间可以检测到较弱的信号，而较短的曝光可以显示更多细节。对一条后腿成像后，将另一条后腿放在相机视野的中心，以与前面所示相同的方式对这条腿进行成像。

为确保结果可比，试样高度应保持不变。成像后，将小鼠转移回笼子，并监测其从麻醉中恢复的情况。为了进行分析，在荧光信号上绘制一个感兴趣区域，以测量每秒的光子数。

我们还以像素数测量感兴趣区域的大小，以获得额外的定量值以获取纵向数据，成像实验可以根据需要在不同的日期或周重复对于实验，在注射 GFP 标记细胞的当天拍摄的小鼠后腿的荧光图像显示出高信号强度。信号强度在第 2 天下降，然后在第 7 天、第 14 天和第 21 天增加到稳定水平。当通过以每秒光子数测量信号强度来量化荧光的这些变化时，我们观察到注射后一天信号强度显着降低，这反映了 GFP 阳性细胞数量的减少。

然而，到第 7 天、第 14 天和第 21 天，信号强度已增加到稳定水平，表明肌肉再生已经发生。我们刚刚向您展示了如何使用体内荧光成像来监测注射 GFP 标记细胞后肌肉再生的进度。使用这种方法，我们能够研究注射各种荧光标记细胞后肌肉再生的动力学。

由于可以以指定的时间间隔非侵入性地获取图像，因此可以用更少的动物和更轻的工作量收集更准确的纵向数据。当使用固定测量参数时，同一动物随时间变化的图像应具有定量可比性。为了减少背景，保持肌肉上方皮肤表面的清洁非常重要，这对于去除覆盖腿部的所有毛发并用棉交换或垫子彻底擦拭该区域是绝对必要的。

请记住，不要忘记每次都使用同一组参数，以确保所有测量结果的一致性。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。