יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

שלום, אני הילרי קמפ מהמעבדה של ססיליה אוונס. ואני ססיליה אוונס. הילרי ואני נמצאות בחטיבה למדעים בסיסיים במרכז לסרטן פרד האצ'ינסון בסיאטל.

היום נדגים לכם טכניקה ליצירת עוברים כימריים של דגים זברופיש (zebrafish), המכונה גם פסיפס גנטי. הליך זה מאפשר לנו להעריך את הבסיס התאי של תפקוד גנים במהלך ההתפתחות. אנו יכולים לבחון האם גן מסוים פועל בתוך תאים בעלי פנוטיפ מוטנטי, תפקוד המכונה תפקוד אוטונומי לתא (cell autonomous function), או בתוך הסביבה של תאים אלו, תפקוד המכונה תפקוד שאינו אוטונומי לתא (cell non autonomy).

אנו יוצרים פסיפסים אלו על ידי השתלת תאים בין עוברים מסוג בר (wild type) לעוברים מוטנטיים, בשלב הבלסטולה או בשלב מוקדם של הגסטולציה. לאחר מכן, אנו מעריכים את תפקוד הגן על ידי תצפית על הפנוטיפ והגנוטיפ של התאים שהגיעו מהתורם בתוך סביבת המאכסן שלהם. אז בואו נתחיל.

בחלק זה של הפרוטוקול, מוזרק צבע שושלת (lineage dye) לעובר התורם, כדי שניתן יהיה לעקוב אחר גורלן של תאים שמקורם בתורם לאחר השתלה. ניתן להזריק בכל פעם סוגים שונים של חומצות גרעיניות באמצעות טכניקה זו; עם זאת, יש להשמיט את שלב הסימון (decoration) בעת הזרקת DNA. לפני העבודה עם העוברים, הכינו את צלחת ההזרקה על ידי החדרת שלב זכוכית בזווית של 45 מעלות בחלק הרחב ביותר של פטרי, מלאה עד לשלושה רבעים ב-1.2% aros in pen strep embryo medium.

הסירה את השקופית לאחר הת굳ות האגרו כדי ליצור תעלה בעלת דופן אלכסונית. מלא את התעלה במצע pen strep embryo. כעת המשך לפירוק האנזימטי של עוברים בשלב תא אחד.

דגרו את העובריים בשלב התא הבודד למשך דקה אחת עד חמש דקות בתוך תמיסת Pronase בריכוז 0.5 mg/mL. עקבו מקרוב אחר תהליך הדה-קורנציה (decoration).

ברגע שהקוריון מתחיל לקרוס באופן נראה לעין, טבלו את העוברים במי המערכת. לאחר מכן שפכו את כל הקוריון החוצה, כאשר העוברים נשארים למטה בתחתית הקימור של הביקר. חשוב מאוד שהעוברים לא יגעו לפני השטח של המים פעם אחת נוספת, ורובם כבר ללא קוריון. ישנם כמה שעדיין מסובבים את עצמם בחלק החיצוני.

אם חלק מהעוברים עדיין נמצאים בתוך הקוריון, פעולת השאיבה בפיפטה באופן זה תוציא אותם ותשחרר את העוברים, כך שלא יבואו במגע עם פני השטח של המים. חשוב לטפל בעוברים מצופים באמצעות פיפטה שעברה ליטוש באש (fire polishing) כדי להחליק את קצותיה. העבירו בעדינות את העוברים השבריריים המצופים ב-dec אל השקע של כלי ההזרקה, באמצעות פיפטת זכוכית רחבה שעברה ליטוש באש.

לאחר מכן, אנו מעבירים קובץ בודד אל תוך התעלה הזו. כעת העוברים מוכנים להזרקת סמן שושלת (lineage marker) באמצעות פיפטת הזרקה מזכוכית שנמשכה באש וכוללBה כיול מדויק, ומערכת הזרקה בלחץ. נשתמש בצלחת מלאה בתווך לעוברים כדי לשבור את המחט ובצלחת מלאה בשמן כדי לכייל את המחט.

זהו שמן מינרלי רגיל בדרגת מעבדה סטנדרטית. אנו לוקחים זוג פינצטות שעונים מושחזות, ולאחר מכן, תוך התבוננות דרך העדשות כדי לקבוע מה יהיה הגודל המתאים, אנו מניחים את הפינצטות משני צדי המחט ושוברי בעדינות את השבב, דבר שאיני יכול לעשות ללא התבוננות. כדי לקבוע את נפח הצבע או הריבונוקלאוטיד שיועבר לפני התחלה.

מדדו את גודל הבולוס בתוך צלחית עם שמן מינרלי. יש לשבור את המחט כך שדחף אחד או שניים של המיקרו-מזרק יספקו בולוס של nanoliter אחד. ניתן לחשב את נפח הבולוס על סמך קוטרו כפי שנמדד באמצעות מיקרומטר של עינית.

הזריקו ננוליטר אחד של תמיסת דקסטראן פלואורסצנטי בריכוז של 1% עד 3% ישירות לתוך החלמון שלו של עוברים מצופים, בין שלב התא הבודד לשלב ארבעת התאים. מה שאעשה הוא למקם את העובר בדיוק מתחת למחט. אדקור את המחט בעדינות למרכז החלמון ואלחץ על דום הרגל.

בעת ההזרקה, חשוב להזריק לתוך זרמי החלמון כדי שהצבע יובחן אל תוך התאים. הזרקה זו תספיק למעקב אחר תאים בעוברים כימריים לאורך מספר ימי התפתחות. באופן אידיאלי, נבצע זאת לפני שהתאים מגיעים לשלב ארבעת התאים. יש לגדל את העוברים המוזרקים בצפיפות נמוכה בצלחת פטרי מצופה ומלאה במצע גידול לעוברים עם pen strep טרי.

שימו לב כי עוברי מוזרקים נוטים להראות קצב התפתחות איטי מעט; דגרו את העוברים בטמפרטורות שונות, 25, 28 ו-31 degrees Celsius, כדי לדרג את התפתחותם ולהרחיב את חלון הזמן שבו ניתן לבצע השתלות. המכשור המשמש להשתלת תאים בבלאסטולה של דג הזברה מורכב ממזרק Hamilton מונחה, המחובר באמצעות ברז תלת-דרכי למאגר של שמן מינרלי ולמחזיק מיקרו-פיפט באמצעות צינור גמיש. הוציאו את כל בועות האוויר מהמערכת, שכן הן יפגעו ביכולתכם לשלוט בשאיבה ובלחץ.

השתמשו במיקרוסקופ סטריאו בעל אופטיקה איכותית עם הגדלה של לפחות DX. כדי לשלוט במיקום מחזיק המיקרו-פיפט והמחט, אנו ממליצים על מיקרו-מניפולטור ידני של NARA shige. ודאו שהוא מקובע לשולחן העבודה באמצעות בסיס מגנטי כדי למנוע העברה של רעידות להשתלה.

מחטים להשתלה עשויות מפיפטות קפילריות מזכוכית שנמשכו לקבלת היטיה עדינה באמצעות מושך פיפטות חשמלי. לעיון בפרטים על משיכת פיפטות תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ראו את פרוטוקול JoVE מהמעבדה של Miriam Goodman; לאחר מכן, יש לשבור את קצה המחט המשוכה. להשתלות בשלב הבלסטולה, קוטר המחט החיצוני צריך להיות כ-50 עד 60 מיקרונים, או 30 עד 40 מיקרונים להעברה בשלב הגסטרולה.

עבור העברה לשלב הגסטרו (gastro stage) לשיפור החדירה, יש למשוך קודם לכן זוברית חדה מקצה המחט באמצעות מיקרו-פורג' (micro forge), ולהחליק את קצה המחט על ידי קרבתו לסליל של המיקרו-פורג'. לאחר מכן, סובב את המחט כך שהקצה המוביל של השחית (bevel) יוכל לבוא במגע עם הסליל. ברגע שהקצה המוביל של המחט נוגע בסליל, משוך אותה במהירות כדי ליצור זוברית.

כדי למנוע פגיעה בתאים, על הזיז להיות ישר וקצה המחט לא צריך להיות מעוקל. לאחר הכנת המערך ומחטי ההשתלה, ניתן להתחיל ביצירת עוברים כימריים. השתלות בשלב הבלסטולה משמשות להעברת תאים בין עוברים כאשר אין צורך במידע מדויק על מפת הגורל. למעט תאי הנבט הראשוניים, רוב התאים אינם מחויבים לגורל מסוים בשלב זה.

מפת הגורל של הבלסטולה היא כזו שניתן להבחין בין תאים שיביאו להיווצרות האקטודרמה לבין תאים שיביאו להיווצרות המזודרמה. התאים המזודרמיים והאנדודרמיים שוכנים סמוך לשולי העובר בשלב הבלסטולה, בעוד שהפרוגניטורים הדֶרמליים, אשר יביאו להיווצרות מערכת העצבים והדרמה השטחית, שוכנים רחוק יותר משולי העובר. לפיכך, כאשר אנו מעבירים תאים לעוברים בשלב הבלסטולה, אנו יכולים לכוון את התאים הללו למזודרמה המשוערת או לאקטודרמה המשוערת.

אך איננו יכולים לכוון תאים לאזור מסוים של האקטודרמה או של המזודרמה כיוון שאיננו יודעים היכן הם נמצאים. בשלב הבלסטולה, שבו נמצא הצד הגבי של העובר, הכינו מראש כלי הזרקה על ידי ציפה של תבנית פלסטיק בעלת שורות זוגיות של בליטות בצורת טריז בתוך פטריה, המולא באופן חלקי ב-1.2% aros מומס בתוך מדיום עוברים. לאחר שה-aros התגבש, הסירו את התבנית כך שיישארו שורות של בארות בצורה משולשת, שכל אחת מהן גדולה מספיק כדי להכיל עובר אחד.

מלאו את תבנית ההשתלה במצע עוברים עם פניצילין וסטראפטומיצין (pen strep), והעבירו עוברים בשלב הבלסטולה באופן פרטני לכל באר באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת באש. כעת העבירו את העוברים לבארי ההשתלה ואפשרו להם בתחילה להישען על צדם. סדרו את העוברים כך שהעוברים התורמים ימוקמו בעמודה אחת והעוברים המארחים ימוקמו בעמודה הסמוכה.

מקם את הצלחת על הבמה כך שכאשר מחט ההשתלה תיכנס לעובר, המחט תדחף את העובר אל הדופן האחורית של הבאר שבה הוא נמצא. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הורד את מחט ההשתלה אל תוך הצלחת בזווית תלולה למדי. באופן אידיאלי, מחט ההשתלה צריכה להיכנס לעובר בזווית של כ-45 מעלות.

ברגע שקצה המחט נמצא מתחת לפני השטח של תווך העובר, שאבו כמות קטנה של תווך העובר אל תוך המחט על ידי סיבוב בורג המיקרומטר השולט במזרק ה-Hamilton. לשם השגת השליטה המדויקת ביותר, יש להקפיד שהממשק שבין השמן המינרלי לתווך העובר יישאר בחלק המצר החלק של המחט, ולא קרוב מדי לקצה. מקמו בעדינות את עובר התורם באמצעות המחט, ולאחר מכן משכו את המחט לאחור והחדירו אותה אל כיפת הבלסטולה של העובר במיקום הרצוי.

מכה חזקה ומהירה תחדיר את המחט לעובר מבלי לגרום לו להתגלגל. שאבו את תאי התורם באיטיות ובזהירות לתוך המחט כדי למנוע גזירה (shearing) של התאים. הימנעו משאיבת חלמון לתוך המחט לאחר ששאוב מספר התאים הרצוי.

הפכו את הלחץ מעט כדי להפסיק את השאיבה והוציאו את המחט כדי להביא את עובר המאחס למיקום הרצוי. באמצעות הזזת צלחת ההשתלה, ניתן לבצע התאמות קטנות במיקום של עובר המאחס על ידי סיבוב עדין שלו באמצעות מחט ההשתלה, כל עוד נשמרת זהירות כדי לא לגעת בחלמון. בעת דחיקת תאי התורם לתוך עובר המאחס, הימנעו משאיבת חלמון לתוך העובר, שכן הדבר יפגע בתאי התורם ויהרוג אותם; תאים מעובר תורם בודד יכולים להיות מושתלים במספר מאחסים לאחר השלמת העברות התאים.

העבירו את זוגות התורם-מארח לבארים המצופות של פלטת 24 בארות להמשך פיתוח. החריג היחיד לכלל לפיו תאים בשלב הבלסטולה אינם מחויבים לגורלות ספציפיים הוא תאי הנבט הראשוניים. תאי הנבט הראשוניים נקבעים בשלב מוקדם מאוד של ההתפתחות ומחויבים לגורל של תאי נבט ראשוניים.

משלב מוקדם מאוד, תאי הנבט הראשוניים שוכנים סמוך לשולי הבלסטולה ועוברי בשלב הגסטולציה. לכן, אם מטרת ניסוי ההשתלה היא להשתיל תאי נבט ראשוניים, הרי שמיקומה של תאי המקור בעובר התורם הוא קריטי, בעוד שהמיקום אליו הם מועברים בעובר המארח אינו משמעותי. בניגוד לכך, הכלל עבור תאים סומטיים הוא שהמיקום אליו הם מועברים בעובר המארח הוא זה שיקבע את גורלם.

במקרה של תאי נבט ראשוניים, מקורם בעוברית התורם הוא קריטי מכיוון שגורלם כבר נקבע. אם המטרה היא להשתיל תאי נבט ראשוניים, יש לאסוף את התאים משולי העוברית התורמת; הם ממוקמים ממש ליד שולי העוברית בארבעה צבירים קטנים, שכל אחד מהם מכיל שלושה או ארבעה תאים, בשלב ה-sphere או בשלב התפתחותי גבוה יותר. יש לאסוף אותם בזהירות רבה כדי לא לשאוב בטעות את החלמון.

בסדר, זה מה שעשיתי עד כה, וכעת אני עובר לעובר המאכסן. כעת תנדנד תאי הנבט הראשוניים אל אזור הרכס הגניטלי של כל עובר שבו הם נמצאים. לכן, אין צורך להשתיל את תאי הנבט הראשוניים הללו לשוליים, הם יגיעו לשם בעצמם.

אם כן, אני פשוט משבצע השתלה ומחזיר אותם לכל מקום רנדומלי בעובר לאחר השלב העוברי. המפתח להשתלות של תאי נבט, שזהו בדיוק ההפך מכל סוג אחר של השתלה, הוא שמקור התאים התורמים הוא בעל חשיבות. השתלת תאים למארח בשלב הגסטולציה מאפשרת לחוקר לנצל את מפת הגורל של דג הזברה (zebrafish) שמתגלה כאשר המגן העוברי (embryonic shield) הופך לנראה.

כעת ניתן להבחין בין סוגי רקמות שונים וכן בין התחומים בתוך מערכת העצבים המרכזית העתידית. בעת העברה של תאים בין עוברים בשלב הגסטולציה, קיימים מספר שינויים בפרוטוקול, אך ההליך הכללי דומה לעבודה עם בלאסטולות להצבת גסטולות. ראשית, מרחו פס אנכי של Methylcellulose בשקע של תית 유리-שקע (glass depression slide), ולאחר מכן מלאו אותו בכמות נדיבה של מצע עוברים עם pen strep באמצעות פיפטה להעברה שעברה ליטוש באש.

העבירו תורם אחד ושלושה מארחים בשלב המגן (shield stage) לשקופית השקע. בחרו עוברים תורמים שצעירים מעט מהמארחים. נדרש כלי חדש לטיפול בדבק הגסטרוס: קשרו את הקצוות של חוט דיג קצר בעומס של 2 פאונד לקצה של צינור קפילרי.

בדרך זו נוצרת לולאה קטנה. השתמשו בלולאה כדי לגלגל בעדינות את העוברים התורמים והמארחים אל החלק העליון של פס מתילצלולוז (Methylcellulose) והדחפו אותם פנימה אל תוך המתילצלולוז עד שהם מעוגנים. גלגלו אותם למצב שבו האזור המיועד נמצא בחלק העליון.

מאחר שבמהלך הש transplantation, המחט תיכנס לעובר באופן משיק כדי להחדיר את תאי התורם מבלי לפגוע ב-ylk. הש transplantation בשלב ה-Gastro מבוצעים בצורה הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ קומפוזיט עם במה קבועה. השתמש בבקרים של המיקרו-מניפולטור כדי להביא את קצה מחט ה-transplantation למיקוד.

מקמו את מחזיק המיקרו-פיפט והמחט בזווית רדודה למדי, כך שהמחט תהיה קרובה ככל הניתן למצב אופקי, בהתאם למה שמאפשר קצה השקע על התבנית. לאחר מכן, דקרו את העובר התורם. אם הוא מקובע כראוי, הוא לא יתגלגל בעת כניסת מחט ההשתלה, אלא אם העובר זקן מדי מכדי לאפשר למחט לחדור בקלות.

כדי למנוע פגיעה בחלמון, על המחט להיכנס לעובר במישור מוקדי העמוק רק מעט יותר מזה של ה-EDL. לאחר הדקירה, ניתן להוציא מספר רב של תאים מהתורם עבור עד שלוש הזרקות של תאי מאכסן. בעת שאיבת התאים, יש להימנע משאיבת החלמון על ידי הזזת המחט בזמן ספיגת התאים, במידת הצורך.

ניתן לאסוף עובריים נוספים כדי להשיג תאים נוספים באמצעות אותה מחט לפני הזרקת התאים למארח. במהלך הזרקת התאים לעובר המארח, יש להוציא את התאים בזמן שמושכים את המחט דרך האזור המיועד, במקום להשקיע את התאים בגוש אחד. פעולה זו תגדיל את הסבירות שהתאי התורם יתרמו לרקמה הרצויה. לאחר השלמת העברות התאים, יש להניח את השקף כולו בתוך צלחת פטרי ולהטביעו בזהירות ב-pen strep embryo Medium.

במהלך השעות הקרובות, המתילצלולוז תתמוסס ותשחרר את העוברים. מספר התאים המועברים תלוי במטרה הספציפית של הניסוי. תאים מתורם יחיד יכולים להיות מושתלים בשלושה או ארבעה מאוכלים בבוקר שלאחר ההשתלה.

ניתן לבחון את המארחים כדי לקבוע אם סימון תאי התורם הצליח. השתלה מוצלחת של תאי נבט ראשוניים מגיל בלאסטולה תביא לתאים מסומנים פלואורסצנטית, הממוקמים בצד הגבי (ventrally) בקרבת הצומת שבין ה-ylk לבין הרחבה של ה-ylk. כך הדגמנו כיצד לבצע השתלות בשלב הגסטולוציה ובשלב הבלאסטולה.

בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לבחור את סוג שיטת ההשתלה המתאימה עבור הרקמה המטרה שברצונכם להגיע אליה באמצעות התאים. לפיכך, השתלה בשלב הבלסטולה מספיקה כדי לקבוע אם התאים מגיעים לדרמה לעומת האקטודרמה. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי להגיע לתאי נבט ראשוניים.

אם ברצונכם לבצע מיפוי מדויק יותר, עדיף להשתמש בשתיל של שלב ה-gastros שבו הצד הגבי כבר נקבע. באמצעות טכניקה זו, תוכלו לכוון תאים לחלקים שונים של מערכת העצבים, ובפרט למובח הגבוה, למובח הבינוני, למובח הנמוך ולחוט השדרה. זהו כל התהליך.

תודה רבה על הצפייה ובהצלחה רבה בכל הניסויים שלכם.