Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae

La phosphorylation est un mécanisme clé de signalisation cellulaire régissant les processus allant de la localisation des protéines à la transcription de l’ADN, et l’étude du phospho seul par spectrométrie de masse est une nouvelle avancée passionnante dans l’étude de la signalisation et de la protéomique. Les cellules marquées différentiellement sont lies par lyse dans un broyeur à boulets, puis réduites alkylées mélangées et digérées. Les peptides digérés sont fractionnés par chromatographie d’interaction hydrophile et les peptides phospho enrichis à partir de fractions par enrichissement iMac.

Les fractions enrichies en peptides phospho sont ensuite identifiées par msm. Bonjour, je suis Ramsey Celine du groupe E de l’Institut de biologie de persistance. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’extraction de peptides phospho marqués métaboliquement.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier quantitativement le protéome de la fosse. Alors commençons. Cette procédure commence par la croissance de cellules de levure isotopiques légères et lourdes.

Tout d’abord, inoculez 100 millilitres de milieu riche avec une seule colonie de cellules de levure. Cultivez cette culture pendant la nuit jusqu’à un OD 600 de 1,0. Ensuite, utilisez-le pour semer deux cultures d’un litre de milieu minimal contenant un complément complet d’acides aminés et complété par 20 milligrammes par litre d’isotopique.

L’arginine et la lysine normales ou isotopiquement lourdes font pousser les deux cultures d’un litre pendant 18 heures à une OD 600 de 1,8. Il est essentiel que les cellules passent par au moins neuf générations pour obtenir une incorporation complète des isotopes marqués. Lorsque les cellules ont complètement incorporé les isotopes marqués centrifugent, les cellules qui ont été cultivées dans le milieu avec isotopiquement, de l’arginine et de la lysine normales.

Pour obtenir une pastille cellulaire, lavez la pastille avec de l’eau stérile et placez-la dans un milieu contenant de l’oléate avec de l’arginine et de la lysine isotopiquement normales et stimulez pendant 85 minutes. Cela donne un échantillon stimulé par l’oléate isotopiquement léger. L’autre culture cultivée dans un milieu contenant de l’arginine et de la lysine isotopiquement lourdes n’est pas stimulée par de l’oléate et servira d’échantillon de référence cultivé en glucose isotopiquement lourd.

Pour recueillir un litre, la culture est répartie entre quatre flacons de centrifugation de 250 millilitres. Après la centrifugation, les cellules sont rassemblées dans un tube en retirant ou seulement 100 millilitres du média Resus, en suspendant les cellules et en les transférant dans le tube suivant. À la fin, une grosse pastille est collectée dans une centrifugeuse à tube unique pendant trois minutes à 4 000 tr/min.

Après avoir retiré le fluide, le poids de la bouteille de centrifugation et des pastilles est comparé à celui d’une bouteille de centrifugeuse vide. Après la centrifugation, retirez le fluide et aspirez l’excès de liquide des bouteilles, pesez les granulés et un rendement typique est compris entre un et deux grammes. Ensuite, congélation instantanée Les granulés dans de l’azote liquide ajoutent un tampon de broyage contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase aux granulés.

Le volume de tampon de broyage ajouté doit être équivalent au poids des granulés. Congelez le récipient de broyage dans de l’azote liquide. Lorsque l’azote liquide a cessé d’bouillir.

À l’aide d’une omoplate, ébréchez la pastille et transférez-la dans le récipient de broyage qui contient des roulements à billes gelés. Broyez les granulés à 600 tr/min avec un cycle 22e d’une minute avec une inversion de direction pendant trois minutes. Recongelez la cuve de broyage dans de l’azote liquide.

Répétez le broyage quatre fois de plus pour un total de 15 minutes. Temps de broyage lorsque le broyage est terminé pour les deux échantillons. Récupérez la datte de broyage congelée dans des tubes de faucon de 50 millilitres et conservez-la congelée soit dans de l’azote liquide, soit dans de la glace sèche.

Conservez la date de mouture à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. L’isolement et le fractionnement des peptides commencent par leur alkylation. La première étape consiste à solubiliser votre échantillon dans la solution d’urée.

Mettez chaque datte de broyage dans la solution en ajoutant trois volumes de tampon d’urée à un volume de date de broyage congelée. Par exemple, trois millilitres de tampon RIA sont ajoutés à une pastille d’un gramme. Avec un millilitre de tampon PBS.

Soniquez immédiatement le mélange avec la sonde. Pointe sonicate. Gardez l’embout près du fond du tube pour éviter la formation de mousse de la solution.

La date de broyage doit immédiatement être mise en solution. Éliminer les lysats par centrifugation à 6 000 tr/min pendant cinq minutes. À quatre degrés Celsius, transférez le SUPINATE dans des tubes frais.

Pour commencer la réaction de réduction, ajoutez du tris molaire de 0,5 molaire fraîchement préparé, deux carboxyles de LITAL PHOSPHINE ou du TCEP à chaque échantillon à une dilution de un à 100. Pour obtenir une concentration finale de PTCE de cinq millimolaires, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation à 37 degrés Celsius, laissez les échantillons refroidir à température ambiante.

Ajoutez ensuite une molaire d’io-acétamide fraîchement préparée à une concentration finale de 20 millimolaires et incubez dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation d’une heure, trempez l’acétamide iota avec 20 millimolaires de DTT. Laissez-le à température ambiante pendant une heure.

Les lysats réduits et alkylés sont maintenant prêts pour la digestion. À ce stade, des échantillons de lysats peuvent être utilisés pour la quantification des protéines, l’analyse de la page SDS pour vérifier la lyse cellulaire et l’analyse par spectrométrie de masse pour valider l’incorporation des isotopes lourds. Pour commencer la digestion, mélangez des quantités équivalentes d’échantillons isotopiques lourds et légers.

Diluez l’échantillon une fois sur quatre avec 20 % de méthanol et ajoutez de la trypsine à raison d’une dilution sur 200. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Après avoir vérifié la digestion complète par la page FDS et la coloration kumasi, séchez l’échantillon dans un aspirateur rapide lorsque l’échantillon est sec.

À 200 microlitres d’eau distillée filtrée et vortex jusqu’à ce que le granulé se dissolve. Séchez l’échantillon dans un aspirateur rapide et mettez-le à nouveau en suspension avec de l’eau distillée Après avoir séché l’échantillon, une fois de plus, remettez la pastille en suspension dans de l’acide acétique trifluor à 0,1 % ou TFA, vérifiez que le pH est d’environ trois à l’aide de bandelettes de pH si nécessaire. Acidifier avec 10 % de granulés TFA éliminer tout précipité.

L’échantillon digéré par l’essai va maintenant être dessalé à l’aide d’un set d’eau VAC 500 milligramme C 18 colonne. Pour commencer, hydratez la colonne avec cinq millilitres, une centrifugeuse 100 % acéto nitrile à environ 200 fois G ou la vitesse minimale requise pour l’écoulement à travers la colonne. Ensuite, équilibrez la colonne avec cinq millilitres, 0,1 % TFA charge l’échantillon.

Veillez à ne pas surcharger la colonne et, si nécessaire, répartissez l’échantillon entre plusieurs colonnes. Récupérez le flux dans un conteneur à déchets et chargez à nouveau la colonne si nécessaire, lavez avec cinq millilitres, 0,1 % TFA. Répétez cette élution de lavage avec deux millilitres de 60 % d’acéto nitrile 0,1 % TFA EEU doit être collecté par centrifugation.

Séchez l’échantillon dans un aspirateur rapide, remettez en suspension l’échantillon séché dans 200 microlitres de solvant B. L’échantillon remis en suspension est maintenant prêt pour le fractionnement peptidique. Fractionnez les peptides sur une colonne analytique TSK gel AMIDE 80 avec une colonne de garde. Prenez votre temps avec un pas.

Exécutez la colonne pendant deux heures à 90 % de solvant A, puis exécutez deux dégradés vides avant de charger votre échantillon. En règle générale, nous ne chargeons pas plus de cinq milligrammes par passage sur une colonne de cette taille, moderne et même pas si moderne. Les machines permettront l’injection automatisée de fractions, le contrôle du débit et les mélanges de gradients.

Ceux-ci sont définis au début de la course comme décrit. Chargez 90 % A sur 20 minutes, 90 % A à 85 % A sur cinq minutes, 85 % A à 60 % A sur 40 minutes, 60 % A à 0 % a sur cinq minutes et 0 % A à 90 % a sur cinq minutes. Réglez le débit à un millilitre par minute et collectez les fractions à deux minutes d’intervalle.

En commençant par le gradient de 85 % A à 60 % A, combinez les fractions pour réduire le nombre de fractions à 10, les fractions augmentées produiront probablement une plus grande couverture du protéome phospho. Les peptides phospho sont enrichis par chromatographie métallique immobilisée. Nous utilisons le gel d’affinité de fer phos select comme résine iMac.

Tout d’abord, les granulés Resus sont suspendus dans 500 microlitres de solution de charge. Ensuite, ajoutez 15 microlitres d’une suspension à 50 % à chaque fraction et incubez les échantillons pendant 30 minutes avec une rotation de bout en bout. Gardez le flux pour l’analyse.

Lavez l’échantillon trois fois avec une solution de charge et une fois avec 500 microlitres d’eau distillée filtrée après les lavages, éluez les peptides pendant deux à trois minutes avec 400 microlitres de 50 millimolaires de tampon de phosphate de sodium. Transférez les peptides élués dans un flacon en verre. Ajoutez cinq microlitres, de l’acide formique à 100 % aux peptides à acidifier à pH trois peptides phospho en suspension dans 200 microlitres de TFA à 0,1 % et dessalez à nouveau avec une colonne C 18 comme décrit précédemment, séchez les échantillons mentionnés dans un aspirateur rapide.

Enfin, remettez en suspension les peptides phospho dans 20 microlitres d’acide formique à 0,1 %. Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés quantitativement par spectrométrie de masse. Une trace graphique chromatique du fractionnement de peptides cellulaires totaux à l’aide de la chromatographie H-I-L-I-C est présentée ici.

On peut observer dans cette trace que si l’on trouve des peptides phospho tout au long du profil elucien, la majeure partie des résidus phosphorylés sont conservés jusqu’à la fin du profil elucien. Nous venons de vous montrer comment broyer des cellules, digérer des protéines, fractionner des peptides a et enrichir pour obtenir des peptides phospho à l’aide de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préserver la phosphorylation et de vérifier les solutions de bière du pH.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.