Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

L'invasione cellulare è un passo importante nella progressione del cancro e nell'angiogenesi. I saggi di invasione in vitro in genere valutano la capacità delle cellule di rompere la membrana basale ricostituita, come la matrice BD, la matrice gel, e di migrare attraverso gli inserti delle colture cellulari. Il test di invasione tumorale inizia quando le cellule vengono aggiunte agli inserti del blocco Fluor rivestiti con gel matri.

Un chemio-attrattivo della membrana basale ricostituita viene aggiunto alla camera basale e il sistema viene incubato. Durante la notte, le cellule invasive saranno in grado di degradare la barriera del gel matri e passare attraverso la membrana a blocchi di flora, una membrana specializzata che protegge il fluoro dalla luce ambientale. Il contenuto della camera apicale viene scartato e l'inserto multipozzetto viene aggiunto a una seconda piastra contenente un Fluor.

Dopo l'incubazione, le cellule vitali vengono colorate e possono essere rilevate sia visivamente che da un lettore di micropiastre. Ciao, sono Jeff Partridge di BD Biosciences Discovery LabWare. Oggi ti mostreremo una procedura per il test di invasione del tumore a blocco del pavimento.

Utilizziamo questa procedura per studiare l'invasione delle cellule tumorali attraverso una membrana basale verso il chemioattrattivo. Quindi iniziamo. Far crescere le cellule per il test di invasione tumorale a circa l'80% di confluenza.

In questo esperimento, utilizzeremo HT 10 80 e N NIH tre linee cellulari T tre. È stato dimostrato che le cellule HT 10 80 migrano e invadono la barriera matrigel nel sistema e quindi fungono da buoni controlli positivi per il test. Le tre cellule T NIH non sono invasive, ma migrano e quindi fungono da buoni controlli negativi per questa procedura.

Per iniziare, il test reidrata il sistema rimuovendo il pacchetto del sistema di invasione tumorale BD bio coat da una conservazione a meno 20 gradi Celsius e lasciandolo raggiungere la temperatura ambiente. Poiché il test richiede una tecnica sterile, lasciare che l'inserto raggiunga la temperatura ambiente nella cappa di coltura tissutale. Una volta che le confezioni sono a temperatura ambiente, aprirle per reidratare la membrana basale attraverso la quale possono passare le cellule di interesse.

A 500 microlitri di terreno caldo all'interno dei pozzetti dell'inserto, lasciare reidratare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Non è necessario reidratare la piastra di inserimento multipozzetto BD Falcon Flora Block 24 non rivestita, poiché verrà utilizzata come controllo della migrazione cellulare per preparare le cellule per il test di invasione. La tripsina è il monostrato cellulare e il resus sospende le cellule nel DMEM libero dal siero a cinque volte 10 per le quattro cellule per millilitro.

Se si utilizza un tipo di cella diverso, la densità di semina ottimale deve essere determinata empiricamente. Dopo la reidratazione della piastra rivestita, rimuovere con cura il terreno dai pozzetti dell'inserto senza disturbare lo strato di gel MA sulla membrana. Il sistema è ora pronto per essere utilizzato.

Non lasciare che lo strato di gel MA si asciughi. Per iniziare il test di invasione cellulare, aggiungere 500 microlitri di ciascuna sospensione cellulare alle camere apicali del sistema di invasione tumorale sia nella configurazione rivestita in matrigel che in quella non rivestita. Quindi, utilizzando le porte del campione per l'accesso, aggiungere 750 microlitri di chemioattrattivo alle camere basali all'interno di piastre rivestite e non rivestite.

È estremamente importante non introdurre bolle durante il riempimento delle camere basali. Come controllo della migrazione, aggiungere ciascuna sospensione cellulare e l'attrattivo chemioterapico alla piastra di inserimento BD Falcon Flora Block 24 Multi WA non rivestita. Incubare il sistema di invasione tumorale e la piastra di inserimento Falcon Flora Block 24 Multi WA non rivestita per 20-22 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica il giorno successivo.

Al termine dell'incubazione, le cellule sono pronte per essere marcate con un colorante fluorescente calcium am. Rimuovere con cautela il fluido dalle camere apicali gettando il contenuto in un contenitore per rifiuti. Quindi trasferire immediatamente il sistema di inserimento in una seconda piastra da 24 pozzetti contenente 500 microlitri per pozzetto di quattro microgrammi per millilitro.

Il calcio è nella soluzione salina bilanciata di Hank. Ripetere questi passaggi con il controllo della migrazione. Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.

Non toccare la superficie inferiore del sistema di inserimento. Al termine dell'incubazione di un'ora con calcio am, è possibile misurare la fluorescenza delle cellule invasori. È della massima importanza che i sistemi di inserti siano rossi utilizzando la corretta mappa delle piastre.

L'orientamento corretto della lastra è con il pozzetto A nell'angolo in alto a sinistra e il logo del falco BD orientato a destra mentre la lastra viene inserita nel lettore, la fluorescenza viene letta a lunghezze d'onda di 494 517 nanometri su un lettore di piastre fluorescenti a lettura inferiore. È necessario verificare i risultati con un microscopio a fluorescenza invertito per assicurarsi che i dati del lettore di piastre corrispondano ai risultati visivi. Si tratta di dati tipici di un lettore di piastre provenienti da una piastra rivestita e da una piastra di controllo non rivestita ottenuti da saggi di invasione cellulare delle due linee cellulari HT 10, 80 e NIH tre, T tre.

I dati provenienti da pozzetti senza celle rappresentano lo sfondo che può essere sottratto prima del calcolo della percentuale di invasione cellulare. Calcola la percentuale di invasione usa la seguente equazione. La percentuale di invasione è uguale alla media delle unità fluorescenti relative o rfu delle cellule che sono passate attraverso la membrana rivestita di matrigel verso l'attrattivo chemio.

Questo è diviso per la RFU media delle cellule che sono migrate attraverso la membrana del blocco del flua VD non rivestita verso l'attrattivo chemio. Questo valore viene quindi moltiplicato per 100. Questo grafico mostra il confronto della percentuale di invasione cellulare tra HT 10 80 e tre cellule T NIH e, come si può vedere, le cellule HT 10 80 sono invasive mentre le tre cellule T NIH non lo sono.

Quando le cellule vengono controllate al microscopio a fluorescenza invertita, i risultati sono coerenti con quelli ottenuti dal lettore di piastre. Le cellule invasive HT 10 80 hanno invaso il matrigel e sono migrate attraverso la membrana non rivestita. Al contrario, le tre cellule T tre NIH non invasive non hanno invaso attraverso il matrigel, ma sono migrate attraverso la membrana non rivestita.

Ti abbiamo appena mostrato come eseguire un test di invasione tumorale a blocchi floreali. Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere le piastre orizzontali e ridurre al minimo la formazione di bolle. Questi potrebbero influenzare i risultati.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.