Name: 蛋白酶荧光检测试剂盒，用它来确定蛋白酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习使用蛋白酶荧光检测试剂盒测定蛋白酶活性，该方法采用FITC标记的酪蛋白底物，通过荧光法检测微量蛋白酶污染，适用于生物样品质量控制与实验室常规检测。

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制备说明
孵育缓冲液、测定缓冲液和0.6 N TCA溶液均为即用型溶液。
FITC-酪蛋白底物——建议在收到FITC-酪蛋白底物后立即分装成小份，以避免反复冻融。若经历多次冻融循环，背景信号会略有升高，从而降低检测灵敏度。分装后的底物应保存于-20 °C，并避光存放。每个样品、空白或对照反应需使用20 μl的FITC-酪蛋白底物。冻融过程以及剧烈混匀或震荡可能导致FITC从酪蛋白上解离，造成背景读数升高，并减少可用于蛋白酶切割的底物量。
荧光素异硫氰酸酯（FITC）对照溶液——可将FITC对照品用测定缓冲液（Assay Buffer）重新配制成适当浓度。该溶液应新鲜配制，并避光保存。
最终的胰蛋白酶对照溶液 - 向胰蛋白酶蛋白酶对照小瓶（货号 T 6567）中加入 100 μl 的 1 mM HCl。短暂混匀以确保胰蛋白酶完全溶解。加入 900 μl 孵育缓冲液并充分混匀。或者，根据实验需要也可使用其他缓冲液。胰蛋白酶的最终工作浓度为 20 μg/μl。当准备配制胰蛋白酶对照溶液时，将一份酸性胰蛋白酶溶液与九份孵育缓冲液按比例混合。在酸性条件下储存可提高胰蛋白酶的稳定性。胰蛋白酶对照溶液对温度敏感，且在低浓度下不稳定。 请查阅试剂盒的技术公告，了解这些配制溶液的储存条件和稳定性信息。
实验步骤
<ol>
<li>建议同时配制对照、空白和样品。对于每个测试样品，在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 待测样品。对于蛋白酶活性较高的样品，可能需要进行稀释。</li>
<li>通过在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 对照样品，配制适当的对照样品（参见对照样品部分）。</li>
<li>通过在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 超纯水，配制空白样品。</li>
<li>轻轻混匀各管，于 37 °C 避光孵育 60 分钟。注意避免剧烈混匀，因为过度涡旋可能导致荧光背景升高，降低检测灵敏度。 注意：可将孵育时间延长至最多 24 小时以提高灵敏度。但切勿超过 24 小时，否则 FITC-酪蛋白可能开始降解，导致荧光背景升高。</li>
<li>孵育结束后，向每支微量离心管中加入 150 μl 0.6 N 三氯乙酸溶液。三氯乙酸具有强腐蚀性，操作时应佩戴适当的个人防护装备。</li>
<li>轻轻混匀后，于 37 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
<li>以 10,000 × g 离心 10 分钟。上清液中含有酸可溶性的 FITC 标记片段，用于后续荧光测定。</li>
</ol>
荧光测量
可根据可用仪器的要求对这些方法进行放大或缩小。为与使用适当对照样品制备的标准曲线进行比较，需从每个测试样品（FLUtest）的荧光读数中减去空白样品（FLUblank）的荧光读数。
比色皿
<ol>
<li>用移液器吸取10 μl上清液（步骤7）和1 ml测定缓冲液至合适的比色皿中，轻轻混匀。注意：上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2–8 °C避光保存最多24小时，之后再进行荧光测定。</li>
<li>在激发波长485 nm、发射波长535 nm条件下记录荧光强度。</li>
</ol>
多孔板
<ol>
<li>用移液器吸取10 μl上清液（步骤7）和1 ml测定缓冲液至合适的试管或小瓶中，轻轻混匀。注意：上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2–8 °C避光保存，最长可保存24小时，之后再进行荧光测定。</li>
<li>将200 μl混合液转移至黑色96孔板的一个孔中。在激发波长485 nm、发射波长535 nm条件下记录荧光强度。 
或者</li>
</ol><ol>
<li>取 2 μl 上清液（步骤 7）和 200 μl 检测缓冲液，加入黑色 96 孔板的一个孔中。注意：上清液与检测缓冲液的混合溶液可在 2–8 °C 避光保存，最长可保存 24 小时，之后再进行荧光检测。</li>
<li>以 485 nm 为激发波长，535 nm 为发射波长，记录荧光强度。</li>
</ol>
对照样本
胰蛋白酶对照溶液可用于确认检测反应是否正常进行、确定检测限或绘制通用标准曲线。对于其他特定蛋白酶的检测，建议配制含有该特定蛋白酶的适当孵育缓冲液作为对照溶液。
该检测方法的检出限是指能够产生显著荧光读数的蛋白酶最低含量，该读数需高于空白样品所得数值。检出限会因仪器的灵敏度不同而有所变化。可通过胰蛋白酶对照溶液的系列稀释来制备所需的对照溶液。
读数达到空白样品所得值的120%时被认为具有显著性。通常情况下，本方法的检测限为5 ng胰蛋白酶。建议每次检测时至少运行一个5 ng胰蛋白酶的对照。浓度为0.5 μg/ml的胰蛋白酶对照溶液可在检测中产生所需的5 ng胰蛋白酶。将胰蛋白酶对照溶液（20 μg/ml）稀释40倍可得到0.5 μg/ml的对照溶液，即1份胰蛋白酶对照溶液与39份孵育缓冲液混合。
<img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="典型的胰蛋白酶活性曲线；荧光单位与胰蛋白酶浓度的关系图" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1（胰蛋白酶活性标准曲线）：可通过将胰蛋白酶对照溶液（20 μg/ml）进行系列稀释来生成标准曲线（见图1）。每个对照样品的荧光读数均通过从其荧光值（FLUcontrol）中减去空白样品的荧光读数（FLUblank）进行校正。
使用本试剂盒和对照样品（浓度范围为 0.15 μg/ml（1.5 ng）至 2.5 μg/ml（25 ng））绘制的胰蛋白酶（产品编号 T 6567）典型标准曲线。该曲线按照所述步骤操作生成，其中第 4 步孵育时间为 30 分钟。荧光检测在多孔板中进行。
荧光素异硫氰酸酯（FITC）用作仪器校准（参见相应制造商的说明书）或确定FITC信号线性范围的对照。

<ol><li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li>
</ol>

作者是 Sigma Aldrich 的员工，该公司生产本文所用的试剂和工具。

我们刚刚展示了一个使用蛋白酶荧光检测试剂盒检测生物样品中蛋白酶活性的示例实验。该试剂盒已针对生理学应用中多种蛋白酶的检测进行了优化，适用于丝氨酸、半胱氨酸、金属和天冬氨酸蛋白酶的检测；但检测某些特定蛋白酶时可能需要进行方法上的调整。

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">蛋白酶荧光检测试剂盒&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">盐酸&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

使用蛋白酶荧光检测试剂盒测定蛋白酶活性

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

蛋白酶荧光检测试剂盒提供了即用型试剂，用于检测蛋白酶活性的存在。该简单的蛋白酶活性检测方法采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白作为底物。
蛋白酶活性导致FITC标记的酪蛋白底物被切割成较小的片段，这些片段在酸性条件下不会沉淀。将蛋白酶样品与底物孵育后，加入三氯乙酸（TCA）使反应体系酸化。随后对混合物进行离心，未消化的底物形成沉淀，而较小的、可溶于酸的片段则保留在上清液中。将上清液中和后，检测其中FITC标记片段的荧光强度。
所述试剂盒可检测约0.5 μg/ml浓度的胰蛋白酶蛋白酶对照（向检测中添加5 ng胰蛋白酶）。通过延长孵育时间至最多24小时，可提高该检测灵敏度。该检测在微量离心管中进行，并提供了使用比色皿或多孔板进行荧光检测的操作步骤。

蛋白酶荧光检测试剂盒旨在利用荧光测定法检测蛋白酶活性，也可用于检测微量蛋白酶污染。该方法基于蛋白酶对一种FITC标记的酪蛋白底物专有配方进行蛋白水解反应。

蛋白酶荧光检测试剂盒提供即用型试剂，用于检测蛋白酶活性的存在。该简易检测方法可用于检测……

本方案首先在微量离心管中加入孵育缓冲液、FXI 酪蛋白溶液以及含有目标蛋白酶的样品，轻轻混匀后于 37 °C 避光孵育 60 分钟。孵育结束后，为终止蛋白水解反应，加入三氯乙酸（TCA）溶液，轻轻混匀，再次于 37 °C 避光孵育 30 分钟。此步骤将导致未反应的底物发生沉淀。将样品以10,000 ×g离心10分钟，弃去上清液，上清液中含有酸可溶性的FXI标记片段。将上清液转移至酶标板或多孔板中，用检测缓冲液稀释后，在荧光计上读取样品。大家好，我是Carrie Cup Vineyard，我在密苏里州圣路易斯市的Sigma Aldridge DeKalb工厂担任科学家。今天我将向大家演示一种荧光法测定蛋白酶活性的实验步骤。我们在质量控制实验室中使用该方法来检测低水平的蛋白酶活性。下面我们开始。本实验所需的孵育缓冲液、检测缓冲液以及0.6 N的三氯乙酸（TCA）溶液均已配制为即用型溶液。将荧光素标记的Cain溶液分装为小份，于-20 °C保存，并注意避光，可使用棕色瓶或将透明管用铝箔包裹。引用分装的Fite Cain底物可最大限度减少反复冻融循环的需要，反复冻融循环或剧烈震荡或混匀Fite Cain可能导致Fite与Cain分离，从而导致背景升高。若需校准荧光计或确定Fite信号的线性范围，请制备Fite对照溶液。通过在测定缓冲液中重新溶解至适当浓度，新鲜配制该溶液。准备就绪后，需将溶液避光保存。最后，通过向一管冻干胰蛋白酶中加入 100 微升 1 毫摩尔盐酸来配制胰蛋白酶对照，轻轻混匀以确保胰蛋白酶完全溶解。在酸性条件下保存胰蛋白酶可提高其稳定性。请注意，胰蛋白酶对照溶液对温度敏感，在低浓度下不稳定。接下来，开始准备所有检测样品，包括测试样品、对照品和空白样品，并在整个检测过程中保持样品避光。在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL FITC-白蛋白底物和10 µL待测样品。可使用透明微量离心管，但样品必须避光孵育。另请注意，蛋白酶活性较高的待测样品需要进行稀释。胰蛋白酶对照样品用作阳性对照，以确认检测方法运行正常，用于确定检测限或绘制通用标准曲线。制备胰蛋白酶对照时，将一份酸化胰蛋白酶与九份孵育缓冲液（或用于测试样品的缓冲液）混合，并充分混匀。胰蛋白酶的最终工作浓度为 20 微克/毫升。若使用其他特异性蛋白酶，请使用该特异性蛋白酶及适当的缓冲液配制对照溶液。继续制备对照样品：在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL弗氏凯因底物（fz cain substrate）和10 µL胰蛋白酶对照品。建议每次检测至少运行一个含有5 ng胰蛋白酶的对照样品，或使用系列稀释法。最后一个样品为空白对照，其制备方法为：在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL弗氏凯因底物（Fitz Caine substrate）和10 µL超纯水。准备好三种类型的样品后，轻轻混匀各管，并在37摄氏度避光条件下孵育60分钟。注意不要剧烈混匀，以免产生过度湍流，导致荧光背景过高并降低检测的灵敏度。可将孵育时间延长至24小时以提高灵敏度，但不建议更长时间孵育，因为FXI酪蛋白可能开始降解。再次强调，当孵育完成后，由于会产生较高的荧光背景，需使用适当的防护设备，向每根微量离心管中加入 150 µL 的三氯乙酸（TCA）溶液。加入 TCA 溶液孵育后，应观察到管内出现白色浑浊，此为沉淀的、未消化且不溶性的肌球蛋白混合物，需轻柔混匀，并在 37 °C 黑暗条件下孵育 30 分钟。TCA 溶液孵育结束后，在室温下以 10,000 ×g 离心 10 分钟。上清液中含有酸可溶性的荧光标记钙蛋白片段，用于荧光检测。用移液器从离心管上层小心吸取，避免吸入沉淀物中的颗粒，否则会在后续荧光检测中导致假阳性结果，从而测量蛋白酶活性。使用荧光计时，将10 µL的TCA上清液与1 mL测定缓冲液在离心管中混合，并轻轻混匀。此外，通过将10 µL的FE加入1 mL测定缓冲液中，稀释FE标准品用于分析。FE对照和胰蛋白酶标准品提供的荧光水平是样品不应超过的阈值。TCA上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2至8°C避光保存，最长可保存24小时后再进行荧光测定。若使用比色皿进行测量，需将一毫升溶液转移至合适的比色皿中；若需检测大量样品，可使用96孔板及荧光酶标仪获取荧光光度数据。在本实验中，异硫氰酸荧光素作为仪器校准可能性的对照。下图显示的是按照所述步骤操作后FS e信号的代表性线性范围。使用该试剂盒，第一步孵育时间为30分钟，可得到典型的胰蛋白酶和对照样品标准曲线，浓度范围为1.5纳克至25纳克。荧光检测在多孔板中进行。该检测方法的检测下限是指能够产生显著高于空白样品荧光读数的蛋白酶含量。今天，我们向您展示了如何使用 Sigma Aldridge 蛋白酶检测试剂盒在生物样品中检测荧光法定量的蛋白酶活性。尽管该试剂盒已针对您的使用进行了优化，但需要记住的是，针对您所研究的特定蛋白酶，可能需要进行一些微小的调整。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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