PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Monolayer-Zellkulturmodelle sind sehr nützliche Werkzeuge für die Untersuchung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs. Diese Modelle sind jedoch nicht in der Lage, die in vivo beobachtete dreidimensionale Umgebung zu rekapitulieren. Dieses Video zeigt die Verwendung von reinem Matrixx, einem kommerziell erhältlichen, selbstorganisierenden Peptidgel zur Verkapselung und Vermehrung der Eierstockkrebszelllinie von CAR five.

Die Zellsuspension wird mit dem reinen Matrixx und der Zellkultur vermischt. Medium wird zur Initiierung des reinen Matrixx hinzugefügt, wenn es in reines Matrixx von Carv verkapselt und kultiviert wird, fügen sich fünf Zellen zu 3D-ASIN-R-Strukturen zusammen, die der Morphologie von mikrometastasierten Knötchen ähneln. Hallo, ich bin Adnan Abbi.

Ich bin Forschungsstipendiatin im Labor von Dr. TBA Hassan am Woman Center for Photo Medicine am Massachusetts General Hospital. Heute zeigen wir Ihnen ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung einer Eierstockkrebszelllinie in einer synthetischen Matrix, der sogenannten reinen Matrix. Wir verwenden dieses Modell, um das Ansprechen auf die Behandlung von Eierstockkrebs in unserem Labor zu bewerten.

Also lasst uns loslegen. Das BD 1%reine Matrix RAD 16 Peptid-Hydrogel hat vor der Verwendung eine Gesamtpeptidkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter. Reduzieren Sie die Viskosität der pur-Matrix, indem Sie sie nach der Beschallung 30 Minuten lang in einem Wasserbad unter Beibehaltung steriler Bedingungen beschallen.

Aliquotieren Sie die 1%ige reine Matrixlösung in sterile Röhrchen Um zukünftige Experimente zu vereinfachen und die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wenn sie sich bilden, schleudern Sie einfach die sterilen Röhrchen mit der reinen Matrix fünf Minuten lang bei 1000 U/min herunter. In dieser Demonstration werden wir zwei Sätze mit vier Vertiefungen mit 2,5 Milligramm pro Milliliter und 1,25 Milligramm pro Milliliter plattieren. Bereiten Sie jeweils zwei Mastermixe aus reinem Matrixpeptid vor, basierend auf der Anzahl der Wells, die Sie plattieren möchten, in diesem Fall acht.

Jeder Mastermix sollte mit dem Doppelten der gewünschten Endkonzentration des Gesamtpeptids hergestellt werden, da er während der Beschichtung mit einem gleichen Zellvolumen verdünnt wird, um die Mastermixe dazu zu bringen, die reine Matrix mit sterilen 10 % Saccharose und 13,3 % Saccharose auf Gesamtpeptidkonzentrationen von fünf Milligramm pro Milliliter bzw. 2,5 Milligramm pro Milliliter zu verdünnen, um eine zweifache Konzentration von reinem Matrixx in 10 % Saccharose zu erreichen, dann aliquotiert 25 Mikroliter des Mastermixes in acht einzelne Röhren. Die reinen Matrix-Mastermixe sind nun bereit für die Verkapselung von Zellen. Die Eierstockkrebszelllinie von CAR five wird in diesem Experiment verkapselt und vermehrt, bevor Trypsin Zellen mit 10 Millilitern sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium für 15 bis 20 Minuten inkubiert.

Aspirieren Sie PBS und Trypsin in einer Zell-Monolayer-Zellkultur, neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedien, die 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthalten. Verwenden Sie mindestens zwei Milliliter Medium pro Milliliter Trypsin, das im vorherigen Schritt verwendet wurde. Übertragen Sie dann die Zellen in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min, um ein Zellpellet zu erzeugen.

Nach der Zentrifugation reus das Zellpellet in 10% steril filtrierter Saccharose suspendieren. Zählen Sie die Zellen und drehen Sie sie fünf Minuten lang wieder mit 1000 U/min herunter. Um Spuren von Salz zu entfernen, die in den Medien gefunden werden, reus suspendieren Sie das O car fünf Zellen in 10%Saccharose bei zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter, so dass die endgültige Zellzahl pro Vertiefung jeweils 5.000 Zellen beträgt. Brunnen.

Die Zellen sind nun bereit für die Verkapselung in der pur Matrixx. Die folgenden Schritte zur Verkapselung von Zellen in der reinen Matrix müssen schnell mit 25 Mikrolitern der zuvor hergestellten Zellsuspension in das erste einzelne Röhrchen durchgeführt werden, das 25 Mikroliter des Mastermixes aus reinem Matrixx enthält. Schnell gemischt, indem man etwa fünfmal im Röhrchen auf und ab pipettiert, ohne dass Luftblasen entstehen.

Pipettieren Sie dann die 50 Mikroliter Zellsuspension reine Matrixx-Mischung in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturschale. Initiierung der BD-Reinmatrix durch vorsichtiges Pipettieren von 150 Mikrolitern Zellkulturmedien an die Seite der Vertiefung. Wiederholen Sie die Schritte zum Verkapseln der Zellen für die verbleibenden Wells.

Denken Sie daran, dass diese Schritte schnell durchgeführt werden müssen und der gesamte Verkapselungsvorgang für eine Vertiefung abgeschlossen sein sollte, bevor mit der nächsten fortgefahren wird. Nachdem alle acht Wells plattiert wurden, führen Sie die Zellen für 30 Minuten Nach 30 Minuten mit einer 200-Mikroliter-Pipette setzen Sie die Pipettenspitze so in die Vertiefung ein, dass sie das reine Matrixbett nicht berührt, und entfernen Sie das Medium sehr vorsichtig aus der Vertiefung. Etwa zwei Drittel des Mediums müssen entfernt werden, um den pH-Wert des Hydrogels auszugleichen.

Verwenden Sie keinen Vakuumsauger, da dies die Matrix stört. Geben Sie anschließend sehr vorsichtig 150 Mikroliter frisches Zellkulturmedium an die Seite der Vertiefung, die Zellen enthält, die in reinem Matrixx verkapselt sind. Entfernen Sie auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt zwei Drittel des Mediums, und fügen Sie den verbleibenden Wells neues Medium hinzu.

Ersetzen Sie die Zellkulturmedien in jeder Vertiefung alle 48 Stunden durch frische Kulturmedien. Es wurden fünf Zellen verkapselt, wie im Verfahren gezeigt wurde. Es werden protokollrepräsentative 3D-Renderings von Bildern von OP-Zellen gezeigt, die an den Tagen 1, 3, 5 und sieben in reiner Matrix verkapselt und kultiviert wurden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Eierstockkrebszelllinie von CAR five und eine synthetische Matrix namens reines Matrixx in Kultur verkapseln können. Wenn Sie also reines Matrixx verwenden, ist es wichtig zu wissen, dass dieses Protokoll für die O Car Fünf-Zell-Linie optimiert wurde. Jeder Forscher muss das Protokoll für seine jeweilige Zelllinie optimieren und feinabstimmen.

Und denken Sie daran, dass es beim Medienwechsel sehr wichtig ist, das Matrixbett nicht zu stören, da es sehr zerbrechlich ist, niemals zu aspirieren und immer eine Pipette zu verwenden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.