הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ"א Bacillus subtilis

זני Baus TLU הנושאים היתוך תרגומי של תיקון אי התאמה. חלבונים שהתמזגו ל-GFP מפוספסים החוצה על מדיה סלקטיבית. תאי הרחוב משמשים לחיסון טרי לתרבית נוזלית.

תאים גדלים עד ש-OD 600 הוא 0.3 עד 0.4, כאשר במקרה של אי התאמה מיושמים טיפולים מעוררי רצוי ותאים הגדלים הלאה עד הגעה ל-OD 600 של 0.5 עד 0.8 תאים מוסרים. כתם הממברנה FM 4 64 מתווסף אם רוצים, ותאים מוחלים על שקופיות עם רפידות ארוס מוכנות ומניחים להם להתיישב לאחר הסרת עודפי מדיה. על ידי שאיפה.

החלקת כיסוי מוחלת ותאים מוצגים במיקרוסקופיה. היי, אני ד"ר אנדרו קאו מהמעבדה של ד"ר לייל סימונס במחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית באוניברסיטת מישיגן אן ארבור. היום נראה לכם הליך המשמש להמחשת איחוי תרגומי של חלבוני תיקון אי-התאמה של ה-DNA, כמו גם חלבוני תיקון וריבוזומים אחרים בבצילוס סולוס.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבוני תיקון אי-התאמה של ה-DNA לבין החלבונים הריבוזומליים בתאים חיים עדינים של בצילוס עדין. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את זני תת-הרשימה B המכילים את חלבון ההיתוך התרגומי שברצונך לדמיין עבור זנים מסוימים.

מספיק להתחיל יום אחד לפני ההדמיה. דוגמאות לכך כוללות זנים שגדלים היטב כאשר ההיתוך התרגומי בין GFP לגן המעניין משולב בלוקוס האנדוגני של הגן כגון MU LGFP. כאשר מתחילים יום אחד לפני ההדמיה, השתמש במקל סטרילי בתנאים סטריליים כדי למרוח את החיידקים על מדיום אגרו LB סלקטיבי על צלחות.

על מנת לגדל מושבות בודדות דוגרות בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס למחרת, המושבות ישמשו לחיסון התחלתי. חלק מזני תת-הרשימה B דורשים יומיים של צמיחה לפני מיקרוסקופיה לתמונות באיכות גבוהה. זנים ספציפיים הדורשים גידול של יומיים הם אלה שגדלים בצורה גרועה עקב האיחוי התרגומי, כגון rec A GFP ביום הראשון, מפספס את החיידקים על LB AED סלקטיבי ודוגר בן לילה.

ביום השני, בצע דילול סדרתי. ראשית בחר מושבה בודדת כדי לחסן 100 מיקרוליטר של 0.85% מלח, ולאחר מכן בצע ארבע צלחת דילול סדרתי פי עשרה 100 מיקרוליטר מכל דילול מי מלח כמו גם מושבת ההתחלה ותמיסת מלח על מאווררי LB המכילים אנטיביוטיקה סלקטיבית דוגרים על הצלחות למשך הלילה, בדרך כלל ב-30 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה השנייה של הלילה. בחר את צלחת הדילול שיש בה גידול קל של תאים.

אלה מספקים חיסון התחלתי בריא וגדל באופן אקספוננציאלי, שעשוי להניב תוצאות הדמיה מצוינות. זה שימושי במיוחד להדמיה באיכות הגבוהה ביותר של צביעת ממברנה. עם FM 4 64 בבוקר ההדמיה הכניסו 10 מיליליטר של S 7 50 בינוני לתוך פלאס סטרילי של 125 מיליליטר.

ובכך שומר על יחס אוויר לבינוני פי עשרה לפחות. החזר את התאים עד שני מיליליטר של S 7 50 מדיום מה-lppl עם מושבות בודדות או תאי מפגש דומים כדי להשיג חיסון. הוסף מספיק חיסון S 7 50 תאים בינוניים לבקבוק Erlin Meyer המכיל 10 מיליליטר של S seven 50 בינוני כך שלתרבית יש OD 600 ראשוני של כ-0.08 עד 0.1.

לאחר מכן, גדל כל תרבית בטמפרטורה המתאימה להדמיית רכבת תת-הרשימה B. אמבטיות מים רועדות עדיפות עם סיבובים לדקה בין 150 ל -200. המשך לגדל את התרביות עד שהן מגיעות ל-OD 600 של כ-0.5 עד 0.8.

עבור תרביות המאותגרות עם גורמים מזיקים או מעוררי אי התאמה ב-DNA, תכננו את הטיפול כך שסוף תקופת הדגירה עם החומר משנה ה-DNA עולה בקנה אחד עם זמן ההגעה ליעד OD 600. לדוגמה, שני אמינו פורין, אנלוגי מבוסס DNA, המחקה בסיס לא תואם כאשר הוא משולב בגנום, דורש דגירה של שעה אחת ומוביל להיווצרות מיקוד של חלבוני תיקון אי התאמה כגון mut LGFP. עם זאת, היווצרות מיקוד REC A GFP דורשת דגירה של שעה אחת עם מיטומיצין C או מגיב נזק אחר ל-DNA לאינדוקציה של שבירות DNA של גדיל כפול מתווספים גם שני אמינו פורין וגם מיטומיצין C.

כאשר התרביות מגיעות ל-OD 600 של כ-0.3 עד 0.4 ולאחר שעת הצמיחה הנדרשת בכל אחד מהטיפולים, סביר להניח שהתרביות יגיעו ל-OD 600 של 0.5 עד 0.8 ומוכנות להדמיה. התחל בפיפטינג של 300 מיקרוליטר של תאים מתורבתים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. אם רצוי הדמיה של ממברנות תאיות בדילול של 1 עד 1000 של מיליגרם אחד למיליליטר FM 4 64 כתם ממברנה לכל דגימה, ייתכן שתידרש טיטרציה של FM 4 64 כדי להשיג את אות הקרינה הרצוי.

טווח טיטרציה טיפוסי הוא אחד ל-100, אחד ל-1001 עד 10,000. אפשר לדגימות לשבת עד 10 דקות או בזמן הכנת השקופית. אם נדרש ריכוז התאים, יש לסנן את התאים באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום.

לאחר מכן שטפו בעדינות את התאים מהפילטר עם מאגר או מדיום מתאים בזמן שדגימות התאים דוגרות. עם FM 4 64. הכן 1% אגרוס עם אחד x zens על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 10 x זן ל -45 מיליליטר מים מזוקקים יחד עם 0.5 גרם אגרוס ומיקרוגל להמסה.

תן לטמפרטורת הארוס להתייצב באמבט מים לכ- 65 מעלות צלזיוס ולמשוך 20 מיקרוליטר של מינים. מסתיים עם 1% ארוס מומס לקצה פיפטה. ארוס חם מדי, קשה לפיפטה ואגרוס קר יתמצק ולא ייכנס לקצה הפיפטה.

לאחר מכן, השתמש בבדיקה מרובת 15. ובכן החלק ופיפטה טיפה אחת של כמיקרוליטר עד שניים מתמיסת הארוס לכל שקופית. ובכן ליצירת רפידות ארוס רדודות, הארוס יתמצק מיד.

השקופיות מוכנות מיד לפני יישום התאים כדי למנוע התייבשות, מה שיהפוך את המגלשות לבלתי שמישות. רפידות הארוס צריכות להיות ממורכזות ולמלא כל באר אך בעלות גובה מינימלי כדי למנוע הפרעה להחלקת הכיסוי. אם הטיפות גבוהות מדי או דמויות בועות או אם הדגימה מתפשטת מעבר לגבול הבאר, פשוט החלק את הבאר עם מגבון קים והחל כרית ארוס חדשה.

כעת, כשהמגלשה מוכנה, החל את כל דגימת המיקרוליטר של 300 מיקרוליטר שהונחה בעבר בצינור המיקרו צנטריפוגה על המגלשה כשהדגימה מופצת בחלק העליון של כל כרית אירוס. כמות תאים זו אמורה להספיק בכדי לכסות כל באר בשקופית. אפשר לשקופית העמוסה בתאים לשבת בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות.

שלב זה יאפשר לתאים להתיישב על משטח האגרוס ולהפוך לחסרי תנועה ולכן מוכנים להדמיה בתום הדגירה של 10 דקות. שאפו את המדיום העודף מכל באר מבלי להסיר את הרפידות עצמן. החל את החלקת הכיסוי על המגלשה ולחץ בחוזקה ובאופן שווה, אך בעדינות על פני אזור בדיקת ההחלקה כדי לוודא שהחלקת הכיסוי נמצאת כנגד המגלשה ושהחלקת הכיסוי אינה מורמת מעל השקופית.

המשך להדמיה של מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רבים ושונים יעבדו היטב. זה קריטי שתהיה עדשת טבילה בשמן פי 100. מעבדת סימונס משתמשת במיקרוסקופ אולימפוס BX 61 המצויד בעדשת אובייקט טבילה בשמן עם צמצם מספרי 1.45 x 100 המתאימה להשתקפות פנימית מוחלטת, מיקרוסקופ פלואורסצנטי או דשא m.

המיקרוסקופ מצויד גם במצלמה מקוררת CCD ומקור אור מתכת קשת LU 200. התחל בהבאת התאים למיקוד באמצעות אור לבן. השתמש בפילטר המתאים לכל פלורה.

ארבעה לזיהוי GFP. השתמש בעירור מסנן ארבע 60 עד 500 ובפליטה חמש 10 עד חמש 60 לזיהוי FM 4 64. השתמש בעירור מסנן חמש 10 עד חמש 60 ופליטה 5 72 עד 6 48.

צלם את התמונה באמצעות המסננים המתאימים לכל קומה. ארבעה עם תוכנת ספר השקופיות 4.2. להלן כמה תוצאות מייצגות של הדמיית חלבון תיקון אי התאמה של ה-DNA MU L, שהתמזג באופן תרגומי ל-GFP.

תרבית הבקרה הלא מטופלת של MU LGFP מציגה מוקדים מינימליים כאשר רוב התאים מכילים רק רמות ציטופלזמיות של חלבון היתוך LGFP מוט. עם זאת, רוב התאים גדלים בנוכחות שני אמינו פורין, המחקה בסיס לא תואם כאשר הוא משולב בגנום. יש מוקדי GFP המצביעים על כך שחלבון ה-GFP המוטאלי מעורב בזיהוי ותיקון בסיסי ה-DNA הלא תואמים.

תוצאות דומות מתקבלות עם זן REC A GFP שגדל בנוכחות התרופה הגורמת לנזק ל- DNA מיטומיצין C. כאן רוב התאים מכילים מוקד של rec A GFP בטיפול במיטומיצין C המצביע על כך שה- rec A GFP הגיב לנזק ל- DNA והחל את תהליך התיקון ללא טיפול במיטומיצין C ב- IR שנראה. זה עתה הראינו לכם כיצד לדמיין חלבוני תיקון בתאים העדינים ביותר של פאסיוס חי. בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לזכור לקחת את הזמן ולהביא את התאים למיקוד נכון ולעשות זאת עשוי למעשה לדרוש קצת תרגול. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.