Name: オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆体細胞への分化プロトコル。レチノイン酸と小分子を用いて30日間で高効率にOPCを誘導し、神経疾患治療研究への応用可能性を示します。

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この作品は、部分的に国立衛生研究所（RO1 NS059043とRO1 ES015988）、全国多発性硬化症協会、貧血の研究、フェルドスタイン医学財団のためのロシュ財団、およびシュライナーズ子ども病院からWDへの補助金によって支えられている。 我々は提案のためにデビッドの喜びとジェニファープレーンを感謝したいと思います。我々はこの記事に関連する一切の競合する利害を宣言しません。

GFP - Olig2マウス胚性幹細胞（mESCs）からオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCを）生成の詳細な手順： <ol><li>マウスES細胞株GFP - Olig2（G - Olig2）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入しています。 mESCsは、日常的に照射したマウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層の上に3日毎に継代されています。 MEF細胞はES細胞を継代する前に少なくとも一日0.1％ゼラチンコートした6ウェル組織培養プレートに播種されています。 MESC培地は、20％ウシ胎児血清（GIBCO）、2mM L -グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMのβ-メルカプトエタノール/、1％非必須アミノ酸（を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（GIBCO）です。 NEAA）、および1,000 U / mlの白血病抑制因子。 </li><li> MESのコロニーは単一の細胞に（TrypLE、5分、37 ° C）をトリプシン処理し、ノックアウト血清代替（KSR）培地に懸濁されて、その後、細胞は細胞でコスター超低アタッチメント6ウェルプレート（コーニング）に転送されます。 50,000細胞/ cm 2の密度。これらの条件では、mESCsは胚様体（EB）を形成する。 KSRの培地は、20％KSR、1mMピルビン酸ナトリウム、1％NEAA、および0.1mMβ-メルカプトエタノール/を補充必須培地（- MEM） - 最小限で構成されています。 </li><li> 4日から7日目に、レチノイン酸（RA、0.2 M）とpurmorphamine（ピュール、1 M）は、図2に示すように含まれています。 KSRまたはN2培地中の1A。 N2の媒体は1X N2サプリメント、1mMピルビン酸ナトリウム、1％NEAA、および0.1mMβ-メルカプトエタノール/を含む- MEMです。培地は毎日変更されます。 </li><li> 8日目で、EBはN2培地および線維芽細胞増殖因子-2（FGF - 2、20 ng / ml）のから構成されるOPCの培地中0.01％ポリオルニチンコートしたディッシュ上TrypLE（5分、37℃）およびメッキを使用して細分化されています。培地は2日毎に変更されます。 </li><li>細胞はトリプシン処理（TrypLE、3分、37 ° C）と彼らがコンフルエントになるとほぼ毎週色を保ち続けるされています。 30日目では、細胞の80％以上がGFP/Olig2表現を見せると、NG2陽性OPCの特徴です。 </li><li>スパイクOPCを生成するには、BacMamのNa +チャネルのキットは、これらのMESC由来のOPCはにのNa V 1.2サブユニットを導入するために使用されます。 BacMam試薬（1 mlの成分）5 mlの最終量になるようにPBSと混合される。その後、混合BacMam試薬はPBSで洗浄する前に60 mmの培養皿（50〜70％の合流点）でMESC由来のOPCは文化に追加されます。 2時間のインキュベーションの後、混合BacMam試薬は1Xエンハンサーを添加したOPCの培地を除去し置き換えられます。エンハンサーは、BはDMSO（成分C）中で再構成するコンポーネントです。次に、追加の2時間のインキュベーションの後にエンハンサーを持つ媒体は完全なOPCの培地を除去し置き換えられます。細胞を24時間後にアッセイされる。 </li></ol>代表的な結果： 図に示すように差別化プロトコルに従って。 1A、G - Olig2のmESCsは、最初に胚様体（EB）（図1B）を形成するためにKSR培地で4日間懸濁した。その後、私たちは順番にRAとピュールでEBSを処理した。 EBは、4日目で、任意のGFPの蛍光を示し、D8（図1B）で強いGFPの蛍光を発現していない。この時点で、EBは成長因子FGF - 2を添加したN2培地でトリプシン処理し、播種した。 22日（D30）さらに培養後、GFP +細胞の割合は80.3に達し、± 0.6％を私たちのフローサイトメトリーの結果によると。図に示す。 1C、GFP +細胞は一貫してNG2染色（96.4 ± GFP陽性細胞の1.3％プラスのNG2、および94.8 ± NG2陽性細胞の1.5％がGFP陽性であった）と重なる。従って、これらの細胞は、OPCとして定義する、GFP/Olig2とNG2を表現。 MESC由来のOPCは（76セル）脱分極（図2A）により活動電位を発生させることに失敗しました。のNa V 1.2サブユニットを運ぶバキュロウイルスで形質導入した後、これらのMESC由来のOPCは（17細胞の94.1％、16）（図2B）スパイクに分類される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 OPCはにGOlig - MESCの分化。胚様体（EB）をベースと小分子駆動型分化のプロトコルを示す（）スキーム。 D8で、EBは、細分化し、メッキだった。彼らがコンフルエントになった時点で細胞は1週間に1回継代した。 （B）D8ではなく、D4 EBは、GFPの発現を示した。 （C）NG2（赤）の免疫染色では、D30でのGFP（緑色）の発現と一致していた。 DAPI（青）は核を識別するために使用されました。スケールバー：20 mmです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。でMESC由来のOPCをnonspikingからスパイクOPCの世代のウイルス媒介セルが0に脱分極した場合でも、 ナトリウムVチャネルの発現。（A）膜電位が-60 mVとMESC由来のOPCが開催されましたが、活動電位を発生させることに失敗しましたmVの。 （B）MESC由来のOPCの例ウイルスの導入後の活動電位を（赤で強調表示）焼成。

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

胚盤胞の胚から単離した胚性幹細胞（ESC）は、オリゴデンドロサイトの仕様を含め、初期の哺乳類の発達を研究するためのin vitroのモデル系の提供、生物3、4のすべての細胞系譜に分化することができる。 mESCsは、ソニックヘッジホッグ（Shh）5の治療法とオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）に分化することが示されている。また、mESCsからShhの誘発性OPCの分化は、胚発生6で観察された正しいタイミングを維持します。したがって、mESCsからin vitroでのOPC 分化の性質は、in vivoでの開発でから学んだされているものと一致するように考えられている。ここでは、小分子RAとShhのアゴニストピュールを使用して、我々は成功し、高効率でGFP + Olig2 + NG2 + OPCはにG - Olig2 mESCsを分化した。 プロテオグリカンNG2 7とヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子Olig2 8の発現によって特徴付けOPCは、、彼らは全細胞のかなりの割合（〜5％）を構成している発展と成熟した中枢神経系におけるオリゴデンドロサイトを、生成する主な増殖細胞のタイプ9。研究者はVチャネル Naは実証しているほぼ二十年のためのOPCの亜集団に発現し、脱分極10,11によって起動することができます。また、最近の印象的な観察​​9は その場ラットの中枢神経系の白質、OPCは（〜50％）生成された活動電位の電位依存性ナトリウム（Na V）チャネルの発現に応じ時に脱分極することであり、したがって、スパイクに細分することができますと亜集団をnonspiking。しかし、これらのスパイクの特性の関数はまだほとんど知られていない。我々は、電気生理学的に、Shhの依存プロトコルで差別化MESC由来のOPCは、 その場脳のOPCの場合と同じではないことがわかった。サブユニットのNa V 1.2を導入した後、これらのサイレントMESC由来のOPCはスパイクのことができた。 従って、MESC由来のOPCは、ここで説明分化プロトコルが容易に可能スパイク/ nonspiking（1）OPCをスパイクとnonspikingの機能の違いを勉強し、（2）スクリーニングMESC由来のOPCのでナトリウムチャネルの発現を促進することができる新しい要因、（ 3）開発と人間のESCまたは誘導多能性幹細胞（性IPSC）からOPCの分化のプロトコルを最適化。

<table><tbody><tr><td>MEF</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

オリゴデンドロサイトは、中枢神経系のmyelinating細胞である。脱髄疾患における再生細胞療法の場合は、移植のための系統にコミットされたオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の純粋な集団を導出に大きな関心が寄せられている。 OPCは、転写因子Olig2とプロテオグリカンNG2の表面発現の活動によって特徴付けられる。 GFP - Olig2（G - Olig2）マウス胚性幹細胞（MESC）レポーターのラインを使用して、我々はGFP + Olig2 + NG2 + OPCはにmESCsの分化のための条件を最適化。我々のプロトコルでは、まずmESCsから胚様体の世代（EBS）を説明します。オリゴデンドログリア系譜に直接EBの分化に定義された培養条件下で（1）レチノイン酸（RA）及び（2）ソニックヘッジホッグ（Shh）アゴニストpurmorphamine（ピュール）：第二に、我々は、小分子とMESC由来のEBの治療について説明します。このアプローチによって、OPCは、30日の期間に高効率（&gt; 80％）で得ることができます。このプロトコルでmESCsに由来する細胞は、一次組織培養から派生したOPCのに表現型が類似しています。 MESC由来のOPCはその場で脳のOPCのサブポピュレーションのために説明するスパイクプロパティが表示されません。この電気生理学的性質を調べるために、我々は、異所的にNaの発現させることにより、MESC由来のOPCをスパイクの発生を説明<sub&gt; V</sub&gt; 1.2サブユニット。このプロトコルから得られたスパイクとnonspiking細胞は、OPCの二つ亜集団での機能研究を進めるのに役立ちます。

我々は、小分子ベースのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）にマウス胚性幹細胞の分化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化の30日間で高効率とOlig2 + NG2 + OPCを生成します。我々はまた、活動電位を発生させることができる&quot;スパイク&quot;OPCを生成する方法を説明します。

オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の髄鞘形成細胞である。脱髄疾患に対する再生細胞療法の目的において、重要な...

本実験の全体的な目的は、30日間にわたる一連の培養ステップを経て、胚性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を生成することです。まず、マウスES細胞から胚様体（embryo bodies）を形成させ、細胞分化を誘導します。次に、胚様体を低分子化合物であるレチノイン酸と純粋なモルヒネで処理し、細胞をリガデン（liga den）へと指向性分化させます。細胞前駆体。第3ステップとして、さらに22日後に胚体を単一細胞へと分散させます。培養細胞の約80%はOPCです。次に、スパイク発生能を持つOPCを生成するために、NAV 1.2サブユニットを搭載したbaoウイルスをMESC由来OPCに導入します。免疫蛍光顕微鏡観察および電気生理学的記録に基づき、これらのMESC由来OPCにおけるOPCマーカーの発現とスパイク特性を示す結果が得られました。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校細胞生物学・人体解剖学部のDr.Ingの研究室のPong Chiangです。私たちは北カリフォルニア・シュライナーズ小児病院にも所属しています。こんにちは、Deng研究室のVial Rajです。本日は、マウス胚性幹細胞をグリア前駆細胞へと分化させる手順をご紹介します。当研究室では、より高い治療潜在能を持つ細胞を生成するため、胚性幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞の特性を研究しており、本手順を用いています。それでは始めましょう。本日は、OG2-GFPマウス胚性幹細胞株からオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を誘導します。これらの胚性幹細胞は、健康な状態を維持し、最適な密度を保ち、また自然分化を防ぐために、3日ごとに継代する必要があります。継代について説明します。ラミナーフローフード内で、ESS細胞が70%コンフルエンスに達した状態で操作を行います。培養液を除去し、PBSで洗浄した後、あらかじめ温めておいたトリプシンを2mL加えて処理します。37 °Cで5分間、1回trip LE expressを行います。反応を停止させ、細胞を4 mLのMES細胞培地で再懸濁します。細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、1000 rpmで5分間遠心してペレット化します。照射済みマウス胚性幹細胞（meth）フィーダー細胞のコンフルエント層上に、MES細胞培地を用いて細胞数の10分の1をMESL培地プレートに再懸濁します。3日後、ES細胞は約70%コンフルエントになり、継代または胚様体形成のための懸濁準備が整います。胚様体を誘導して分化を開始させるため、前述と同様にマウスES細胞コロニーをトリプシン処理し、その後、ノックアウト血清代替物（KSR）またはKSR培地に細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞数を数え、KSR中で懸濁液を希釈します。15,000 cells/mLに調整した培地を、超低接着6ウェルプレートの各ウェルに3 mLずつ分注して培養します。懸濁細胞を37 °Cで4日間培養してください。2日ごとに培地を完全に交換します。4日目から、培地を毎日交換します。4日目には、KSRに0.2 µMのレチノイン酸を添加します。5日目には、レチノイン酸と1 µMのプリモルファミンを両方添加し、6日目と7日目にも同様に添加します。胚体（embryo bodies）を、0.2 µMのレチノイン酸と1 µMのプリモルファミンを添加した培地で培養します。培養8日後、大部分の胚体がGFPを発現し、分散可能な状態になります。前述と同様にトリプシン処理を行い、細胞数をカウントします。その後、細胞を3.5 × 10⁵ cells/mLの密度で再懸濁します。OPC培地を用いて、懸濁液3 mLをOPC培地へ再注入します。ポリオルニシンコートした60 mmディッシュを使用し、約1週間ごとに細胞がコンフルエントになり、このような外観になります。これまでと同様に、3分間のトリプシン処理により細胞を継代します。最初の再懸濁から30日後。KSR培地において、細胞は発火能を持つOPCを生成するためのオリゴデンドロサイト前駆細胞の特性を示します。コンフルエンシーが50%から70%の間であるマウスESL由来のOPCを使用してください。培地をXPBSに交換し、細胞を洗浄します。電位依存性ナトリウムチャネル1.2αサブユニットを導入します。back MAMナトリウムチャネルキットを使用します。1 mLのback MAMコンポーネントAを4 mLの1X PBSと混合します。PBSリンス液を除去し、希釈したコンポーネントを添加します。37 °Cで2時間インキュベートします。キットの説明に従い、成分BおよびCを添加したOPC培地でバックメモリー剤を置換します。さらに37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、増強培地を新鮮なOPC培地と交換します。さらに24時間培養した後、この時点でESL由来のOPCのスパイキングをアッセイできます。EBSではGFP蛍光は認められません。EBSは強いGFP発現を示し、元の再懸濁液からの懸濁後約30日で分散培養が可能な状態になります。KSR培地において、大部分の細胞がNG2染色で免疫陽性となり、これはGFPの発現と一致しています。しかし、脳由来のOPCとは異なり、これらのMES細胞由来OPCは、細胞を0 mVまで脱分極させた場合でも活動電位を発生させることができませんでした。ウイルス導入によりNAV 1.2サブユニットを導入した後、これらのmES細胞由来OPCは興奮し、活動電位を発生させます。これまで、マウス胚性幹細胞をOPCに分化させ、ウイルス導入によってスパイク発生OPCを生成する方法について説明しました。この手順を行う際は、レチノイン酸、モリフォリン、FGF2を適切に保存し、常に新しい分注液を使用すること、および使用後の余剰なレチノイン酸は廃棄することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Biology

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