Essai de fosse de résorption : une technique in vitro pour quantifier l’activité de résorption calcique des ostéoclastes matures à l’aide de plaques de culture enrobées de phosphate de calcium

Les ostéoclastes, macrophages multinucléés, facilitent la résorption osseuse - la dégradation du tissu osseux et la libération de minéraux osseux.

Pour quantifier la résorption des ostéoclastes in vitro, cultiver des cellules mononucléées du sang périphérique humain dans le facteur de stimulation des colonies de macrophages, M-CSF, contenant des milieux de différenciation en cellules progénitrices ostéoclastes et attachement. Récoltez les progéniteurs des ostéoclastes et centrifugez.

Pipetez la suspension cellulaire en suspension dans un milieu, complétée par du M-CSF et l’activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire kappa-B, RANKL, dans des puits à plaques multi-puits recouverts de phosphate de calcium, imitant le composant osseux inorganique. Le M-CSF et le RANKL provoquent la différenciation des progéniteurs ostéoclastes et leur fusion en ostéoclastes, activant la résorption.

Les ostéoclastes activés se fixent à l’enrobage de phosphate de calcium, réorganisant leur cytosquelette pour former une zone d’étanchéité riche en actine et développent des bordures ébouriffées, qui sécrètent des protons et des hydrolases acides. L’environnement acide qui en résulte dissout l’enrobage de phosphate de calcium, libérant des ions calcium et phosphate et formant une fosse de résorption.

Après l’incubation, laver les puits en éliminant les ions dissous. Fixez et perméabilisez les ostéoclastes pour les colorations ultérieures. Teindre les filaments d’actine avec un colorant approprié. Contre-colorez les noyaux avec un colorant de liaison à l’ADN. Teindre le calcium dans le revêtement du puits avec un colorant liant le calcium.

Sous un microscope à fluorescence, les ostéoclastes fonctionnels présentent plusieurs noyaux fluorescents et anneaux d’actine, cruciaux pour la fonction de résorption. Les fosses de résorption apparaissent sous forme de zones noires sur le revêtement fluorescent de phosphate de calcium recouvert par les cycles d’actine.

À l’aide d’un logiciel approprié, quantifiez la surface de la fosse, en déterminant la résorption ostéoclastique.

Remettre en suspension des PBMC dans un alpha-MEM complet contenant 20 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages, et ensemencer 2,5 x 10 PBMC^{de 5} cellules/cm² dans un flacon. Incuber les plaques enrobées de phosphate de calcium avec 50 microlitres de sérum fœtal bovin à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, lavez le ballon deux fois avec du PBS pour détacher les précurseurs des ostéoclastes des cellules mortes ou non adhérentes. Ensuite, ajoutez 4 millilitres de trypsine par flacon de 75 cm². Après 30 minutes, arrêtez la digestion en ajoutant 4 millilitres d’alpha-MEM complet. Ensuite, détachez soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.

Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et comptez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Centrifugez le tube à 350 x g pendant sept minutes pour granuler les cellules, et mettez à nouveau en suspension la pastille dans de l’alpha-MEM complet contenant du M-CSF et du RANKL pour obtenir 1 x 10⁶ cellules/mL.

Aspirez le sérum fœtal bovin de la plaque recouverte de phosphate de calcium et pipetez 200 microlitres de suspension cellulaire par puits. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et lavez-les à nouveau avec du PBS.

Pour la coloration, ajoutez un tampon de perméabilisation aux cellules fixées et incubez-les pendant cinq minutes.

Pour colorer les filaments d’actine, incubez les cellules avec 100 microlitres de solution de phalloïdine marquée à AlexaFluor 546 dans du PBS pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez la solution de coloration et colorez les noyaux à l’aide de 100 microlitres de Hoechst pendant 10 minutes.

Teinture de phosphate de calcium avec 100 microlitres de 10 micromolaires de calcéine dans du PBS pendant 10 minutes. Après avoir lavé trois fois avec PBS, capturez des images.