Mesure de la charge bactérienne d’E. coli chez Drosophila melanogaster après une infection à E. coli

Commencer avec des mouches Drosophila melanogaster adultes injectées avec E. coli. Aux moments souhaités après l’injection, transférez les mouches anesthésiées dans des tubes de microcentrifugation séparés sur de la glace, réduisant ainsi leur activité métabolique.

Ajoutez un tampon et homogénéisez les mouches, décomposant les tissus, libérant E. coli et le microbiote intestinal endogène.

Transférez chaque homogénat de mouches contenant E. coli dans des puits à plaques multipuits. Remplissez les puits restants avec un tampon. Effectuer une dilution en série de l’homogénat contenant E. coli.

Déposez la suspension d’homogénat dilué de chaque puits ainsi que des points discrets sur une plaque de gélose nutritive, en commençant par la dilution la plus faible. Laissez les taches absorber dans la gélose. Incuber la plaque pendant la nuit pour permettre la multiplication d’E. coli, formant des colonies visibles. La durée d’incubation est essentielle pour empêcher la formation de colonies endogènes du microbiote intestinal de la mouche.

Comptez les colonies d’E. coli pour chaque mouche à partir des dilutions avec des colonies non chevauchantes. Calculez l’unité formant la colonie – la charge bactérienne viable – dans l’homogénat de départ à différents moments après l’injection.

La diminution de la charge d’E. coli au fil du temps suggère l’élimination bactérienne par le système immunitaire de la mouche.

Placez un sous-ensemble de mouches infectées dans des tubes de microcentrifugation individuels sur de la glace. Ajoutez 250 microlitres de PBS dans chaque tube et utilisez un pilon pour homogénéiser les mouches. Ensuite, plaquez l’homogénat sur une plaque de gélose LB à l’aide d’une plaque en spirale.

Alternativement, pour plaquer l’homogénat par dilution en série, transférez chaque homogénat de mouches sur la première rangée d’une plaque de 96 puits et remplissez chaque puits des rangées restantes avec 90 microlitres de PBS. À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 10 microlitres de la première rangée contenant de l’homogénat de mouches et distribuer l’homogénat dans la deuxième rangée.

Pipetez de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger l’homogénat, puis prenez 10 microlitres d’homogénat et transférez-le dans la rangée suivante. Répétez cette procédure en utilisant les rangées restantes. En commençant par la rangée du bas, utilisez la pipette multicanaux pour prélever 10 microlitres de chaque puits et déposez-les sur une plaque LB.

Assurez-vous que les échantillons sont distribués sous forme de points discrets qui ne se touchent pas. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les puits aient été échantillonnés dans chaque rangée, en les distribuant par ordre décroissant de dilution sur la plaque LB. Quelle que soit la méthode de placage utilisée, veillez à ne pas trop envahir les plaques afin que les colonies restent petites et discrètes.

Retirez la plaque de l’incubateur une fois que les bactéries expérimentales ont développé des colonies visibles, mais avant que les colonies du microbiote intestinal de la drosophile ne deviennent visibles environ 24 heures plus tard.

Pour les plaques en spirale, comptez les colonies qui se développent à l’aide d’un compteur de colonies automatisé qui peut estimer la charge bactérienne par millilitre d’homogénat, en fonction du nombre et de la position des colonies sur la plaque.

Pour les plaques ponctuelles, comptez manuellement les colonies de chaque mouche à partir de la dilution contenant de 30 à 300 colonies, et calculez le nombre de bactéries par millilitre d’homogénat d’origine.