Индукция экспериментального аутоиммунного гипофизит в SJL Мыши

Аутоиммунный гипофизит характеризуется увеличением доли гипофиза и дефицитом одного или нескольких гормонов гипофиза. Возбудитель аутоантигенов остается неизвестным. Сопутствующее видео демонстрирует протокол приготовления иммуногена гипофиза у мыши, который будет использован здесь для создания модели мыши, напоминающей человеческий аутоиммунный лимфоцитарный гипофизит.

Иммуноген гипофиза вводится восприимчивой линии мыши. Затем инъекцию повторяют через семь дней, через 14 дней, собирают кровь для исследования биомаркеров. На 28-й день у убитых мышей собирают гипофиз, разрезают и окрашивают, чтобы определить степень инфильтрации лейкоцитов.

Аутоиммунный гипофизит является все более признанным заболеванием, которое может быть трудно отличить от других новообразований, не секретирующих гормоны, которые возникают в целлике. Несмотря на то, что заболевание было впервые описано около 50 лет назад, аутоантигены, распознаваемые иммунной системой пациента при аутоиммунном гипофизите, остаются неуловимыми. В 2008 году мы опубликовали разработку модели мыши, которая точно повторяет болезнь человека, которую она должна была имитировать.

Эта мышиная модель может быть использована для обнаружения вовлеченных в него аутоантигенов гипофиза и получения дополнительной информации о патогенезе и естественной истории гипофизита. Модель основана на введении белков гипофиза мыши в восприимчивый штамм, такой как штамм SJL. Эти белки необходимо смешивать с сильным адъювантом для того, чтобы создать местную воспалительную среду, которая в конечном итоге индуцирует появление аутореактивных лимфоцитов гипофиза.

Сначала в лимфоузлы, дренирующие место инъекции, а затем в гипофиз. Модель требует введения относительно большого количества белков гипофиза, в общей сложности два миллиграмм на мышь. Это говорит о том, что аутоантиген или аутоантигены cosset присутствуют в незначительных количествах в фертильной железе Инъекция правильно подготовленного препарата имеет решающее значение для индукции заболевания, поскольку это приводит к медленному, непрерывному высвобождению белков гипофиза в местах инъекций, в конечном итоге поддерживая генерацию и активацию гипофизарно-специфических лимфоцитов.

В сопутствующем видео представлен метод получения иммуногена гипофиза. Гипофиз, выделенные у усыпленных мышей, гомогенизируют и осветляют с помощью низкоскоростного центрифугирования. Белковая смесь оценивается по количеству с помощью колорометрического анализа, анализа БЦА и качества с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Затем гомогенат водного белка смешивают с маслянистым адъювантом, содержащим неактивные палочки микобактерий туберкулеза, для получения гипофизарной эмульсии. После приготовления эмульсии, как показано в сопутствующем видео, извлеките микроэмульгирующую иглу из одномиллилитрового шприца и прикрепите иглу 25 калибра. Для каждой инъекционной мыши требуется 100 микролитров эмульсии гипофиза.

После обезболивания мыши Эвертоном убедитесь, что у нее нет реакции на защемление пальца ноги, затем введите 50 микролитров эмульсии подкожно в область левой спинной задней ноги. Убедитесь, что кончик иглы полностью находится под кожей и что эмульсия не вытекает из места инъекции. Далее введите 50 микролитров в правую паховую область.

Опять же, убедитесь, что ничего не сочится. Обратите внимание, что эмульсия имеет беловатый оттенок и ее может быть трудно различить в контексте белого фона шерсти мыши SGL L после инъекции. Верните мышь в клетку и следите за ее восстановлением.

Наблюдайте за мышами, которым была введена инъекция, ежедневно в течение первых трех дней после инъекции, чтобы убедиться, что не возникает сильного стресса. Адъювант является провоспалительным, так как содержит инактивированный m tuberculosis. Бациллы на седьмой день повторите инъекцию на противоположные анатомические стороны.

Введите 50 микролитров в правую спинную область голени и 50 микролитров в левую паховую область. Наблюдайте за мышью, так как до этого результаты эксперимента будут оцениваться после того, как произойдет иммунный ответ. Кровь — это ткань, которая чаще всего используется для оценки результатов экспериментов, пока мыши еще живы.

Кровь обычно берут через 14 дней после первой иммунизации для измерения сывороточного уровня антител гипофиза или других маркеров, таких как цитокины и хемокины. Чтобы собрать кровь у живой мыши, надежно держите животное за загривок шеи и найдите заднюю часть челюстной кости. Как только это место станет ясным, проколите подчелюстной сосудистый пучок четырехмиллиметровым ланцетом.

Из места прокола начнет выделяться кровь. Соберите шесть капель крови в микроцентрифужную пробирку. Очистите место прокола влажным бумажным полотенцем, чтобы остановить кровотечение.

Поместите пробирки с кровью в центрифугу и вращайте ее до 2000 г в течение 20 минут. Это центрифугирование отделяет клетки крови, которые в конечном итоге окажутся в грануле от сыворотки. Переложите сыворотку в новую микроцентрифужную пробирку.

Храните сыворотку при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока она не понадобится. Иммунизированным мышам требуется примерно один месяц, чтобы развиться полномасштабный аутоиммунный гипофизит. Поэтому мышей обычно убивают через 28 дней после первой иммунизации.

Разрезав череп, поднимите мозг и переверните его назад, чтобы обнажить гипофиз. Больной гипофиз выглядит опухшим и более прочно прилипшим к окружающим мозговым оболочкам. Перемещайте кончик острых щипцов вокруг гипофиза, чтобы разорвать мозговые оболочки.

Как только гипофиз будет свободно двигаться по этой феновой кости, возьмитесь за один конец железы щипцами и осторожно приподнимите его с этой феновой кости. Поместите ткань в микроцентрифужную пробирку, содержащую один миллилитр раствора на основе цинка, и зафиксируйте железу на ночь при комнатной температуре. На следующий день перенесите гипофиз на лист линзовой бумаги.

Оберните гипофиз в хрусталик и поместите его в гистологическую кассету. Обрабатывайте образец путем инкубации и увеличения концентраций спирта, а затем ксилола после обработки. Снимите с линз бумагу и поместите гипофиз в металлическую форму.

Затем покрыть гипофиз парафином. Поместите тканевую кассету поверх формы и заполните ее дополнительным парафином. Наконец, поставьте сборку на лед, чтобы парафин застыл.

Как только парафин застынет, с помощью микротома вырежьте секции толщиной пять микрон. Поднимите срезы на предметное стекло. Соберите не менее пяти непоследовательных срезов на одном и том же предметном стекле из гипофиза каждой мыши.

Окрашивайте предметные стекла гематином и эозином с помощью автоматизированной станции окрашивания тканей. Рассмотрите предметные стекла с помощью светового микроскопа, чтобы собрать результаты. Кардинальной особенностью гипофиза, в котором развился гипофизит, является его инфильтрация лимфоцитами, которые проявляются в виде небольших голубых клеток, которые просачиваются через паренхиму гипофиза изолированно или образуют кластеры.

Лимфоциты связаны с различной степенью разрушения нормальных эндокринных клеток гипофиза. Участок с наиболее выраженной лимфоцитарной инфильтрацией и деструкцией гипофиза выбран для оценки двумя исследователями, слепыми к условиям эксперимента. Оценка основана на субъективной оценке степени ущерба.

Нулевой балл указывает на нормальный гипофиз или редко наблюдаются лимфоциты и другие мононуклеарные гемопоэтические клетки. Оценка 1 указывает на то, что мононуклеарная инфильтрация занимает от 2 до 20% от общей площади передней доли гипофиза. Оценка 2 указывает на то, что мононуклеарная инфильтрация занимает от 20 до 30% от общей площади передней доли гипофиза.

Оценка в три балла указывает на то, что мононуклеарная инфильтрация занимает от 30 до 50% от общей площади передней доли гипофиза. Оценка четыре балла указывает на то, что мононуклеарная инфильтрация занимает от 50 до 90% от общей площади передней доли гипофиза, а оценка 5 баллов указывает на то, что мононуклеарная инфильтрация занимает почти всю переднюю область гипофиза. После освоения инъекция иммуногена одной мыши может быть выполнена за 15 минут.

Забор периферической крови у одной мыши может быть выполнен за пять минут, а подготовка предметных стеков для гистопатологии — за шесть часов при попытке проведения процедуры иммунизации. Важно уделять пристальное внимание здоровью мыши после анестезии и инъекции иммуногена. В дополнение к ямной гистопатологии питу.

Эта процедура может быть использована для сбора широкого спектра экспериментальных результатов с использованием различных методов, таких как оценка субпопуляций счетов-фактур в дренирующих лимфатических узлах с помощью проточной цитометрии. Методика иммунизации с помощью экстракта ткани для лечения индукционных и аутоиммунных заболеваний открывает исследователям в области аутоиммунных заболеваний путь к обнаружению ключевых событий патогенеза заболевания. После просмотра этого видео у него должно быть хорошее понимание того, как иммунизировать мышей для индуцирования экспериментального аутоиммунного гипофизита и как оценивать его случаи и тяжесть.

Не забывайте, что работа с микротоновыми лезвиями может быть опасной. Эти и поэтому меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа при хорошем освещении, должны приниматься всегда.