이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

G-단백질은 내부로 정류하는 칼륨 채널 또는 grk로 뉴런의 흥분성을 조절하는 데 중요합니다. Gks는 무스카린 수용체 M two R과 같은 G-단백질 결합 수용체 GPCR과 알코올에 의해 활성화되어 gerk 알코올 결합 부위의 돌연변이 효과를 연구할 수 있습니다. 활성화 시, 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 단일 점 돌연변이가 grk CD NA에 도입되고, 정제된 gerk 구조체가 YFP 구조체와 함께 포유류 세포에 transfection되고, 형광 이미징에 의해 transfection 효율이 평가됩니다.

그런 다음 전체 세포 패치 클램프 분석을 수행하여 알코올 및 G-단백질 의존성 활성화를 비교합니다. 이 시각적 실험 데모는 LY 채널의 기능을 연구하는 방법에 대한 주요 정보를 제공합니다. 오늘은 알코올이 어떻게 집단 채널을 활성화하는지에 대한 질문을 살펴보려고 한다.

여기에 표시된 부위 유도 신생(site directed neogenesis) 기법은 이온 채널 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 유전자의 돌연변이가 인간 질병을 유발하는 것으로 알려진 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이것들은 핫 셀 패치의 시연입니다 등반 기술은 사용 가능한 데이터를 생성하기 위해 정밀하고 적절한 전자 보상 및 연습이 필요한 많은 단계가 있기 때문에 중요합니다.

이 프로토콜에서 transfection에 사용되는 DNA는 다음과 같이 제조됩니다. 먼저, GRK subunit, PCR의 DNA는 포유류 발현으로 직접 복제됩니다. Plasmid PC DNA 3.1 point mutation은 quick change XL two site directed mutagenesis kit와 함께 적절하게 설계된 primer를 사용하여 도입됩니다.

이 시스템을 이용하여 전체 plasmid를 복제하는 PCR을 수행하고, primer에 의해 암호화된 point mutation을 도입합니다. PCR 후, 복제된 플라스미드는 DPN one 제한 효소로 절단된 다음 열 충격에 의해 XL 10 gold ultra competent e coli로 형질전환됩니다. 형질전환된 박테리아는 LB 한천 플레이트에서 성장하며, 플라스미드를 품고 있는 암피실린 박테리아는 암피실린에 내성이 있으며 콜로니를 생성합니다.

고립된 군체는 미니 배양에서 선택되고 성장합니다. 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 미니 프렙(Mini prep)이 수행됩니다. 그런 다음 성공적으로 형질전환된 돌연변이를 식별하기 위해 DNA의 염기서열을 분석합니다.

대장균은 더 큰 배치로 성장하고, 2개의 웰 각각에 5개의 HEC 2, 9, 3 T 세포에 약 10배의 더 많은 양의 플라스미드 DNA 플레이트를 준비하기 위해 맥시 프렙을 수행합니다. 12 웰 플레이트에서 하나는 돌연변이용이고 다른 하나는 대조군용입니다. 야생형 채널은 섭씨 37도에서 배양합니다.

8시간에서 24시간 후에 세포가 기질에 부착되어 transfection할 준비가 됩니다. 제조업체의 지침에 따라 0.2 마이크로그램의 채널 CDNA, 0.4 마이크로그램의 M, 2개의 R 수용체 CDNA 및 0.04 마이크로그램의 Y-F-P-C-D-N-A로 세포를 transfection합니다. 성공적으로 transfection된 세포를 식별하기 위해 24시간 동안 세포를 배양합니다.

원하는 배양 시간이 경과한 후 세포를 도립 형광 현미경의 스테이지에 올려 놓고 형질 주입 효율을 측정합니다. 형광 이미지와 DIC 이미지를 비교하여 transfection된 세포의 비율을 확인할 수 있습니다. 배양 접시를 인큐베이터로 다시 반환합니다.

12mm 유리 커버 슬립을 청소하고 사용할 때까지 에탄올에 보관하십시오. 멸균 캐비닛에서 불을 피워 잔류 에탄올을 제거하십시오. 커버 슬립을 24웰 플레이트에 넣고 밀리리터당 0.2밀리그램으로 코팅합니다.

Poly de lycine 형질주입 24시간 후 트립신은 세포와 플레이트를 4배 10배로 3개의 세포에 잘 관찰합니다. poly de lycine 코팅 유리 커버 슬립을 포함하는 24웰 접시의 4-8웰에서 도매 패치 클램핑을 수행하기 전에 추가로 24-48시간 동안 배양합니다. 2단계 수직 풀러와 보로 실리케이트 전극 유리를 사용하여 패치 전극을 준비합니다.

이상적으로, 완성된 전극은 3-7메가옴의 저항을 가지며 열 연마와 같은 추가 조작이 필요하지 않습니다. 패치 클램핑의 경우, 20 밀리몰 칼륨 또는 20 K 외부 용액이 들어 있는 35mm 접시에 형질 주입된 세포가 있는 커버 슬립을 놓습니다. 접시를 무대에 놓습니다.tage 반전 형광 현미경의.

여기에 사용된 패치 클램핑 설정은 관류 시스템을 사용합니다. 이 시스템에는 매니폴드에 연결된 튜브를 통해 중력이 공급되는 세포에 적용될 세포 외 솔루션이 포함되어 있습니다. 각 솔루션은 솔레노이드 핀치 밸브로 원격으로 제어됩니다.

DIC를 사용하여 세포에 초점을 맞추고 세포를 찾을 수 있습니다. YFP 필터로 전환하여 YFP 양성 셀을 찾습니다. YFP 양성 세포가 확인되면 관류 시스템의 끝부분인 신경 형광 세포를 20-30미크론 또는 2-3세포 길이 떨어진 곳에 배치합니다.

전극에 내부 전극 용액을 채웁니다. 주사기와 유연한 바늘을 사용하여 채워진 전극을 부드럽게 두드려 팁에서 기포를 제거합니다. AXO 패치 200B 증폭기의 헤드 스테이지에 전극을 부착합니다.

의 설정이 ampliifier는 다시 하나의 구성과 같습니다. 전체 셀 스위치는 beta가 1이고 저역 통과 용기 필터는 10kW로 설정됩니다. 주사기와 클램프로 양압을 가하여 전극 팁을 깨끗하게 유지하십시오.

그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극 끝을 수조에 놓고 셀 위로 이동합니다. 전환 ampliifier를 V 트랙 모드로 전환하고 미터 노브를 V 트랙으로 전환합니다. 그런 다음 증폭기의 파이펫 오프셋 전위 미터를 사용하여 증폭기 미터 디스플레이의 전압을 0.00으로 가져와 파이펫 전위를 0으로 만듭니다.

또는 V cl로 전환ampliifier를 선택하고 테스트 펄스 버튼을 선택하여 테스트 볼륨을 제공합니다.tage 단계. 직사각형 전압 단계는 클램프의 밀봉 테스트 창에 나타납니다. 증폭기의 피펫 오프셋을 조정하여 기준선 전류를 0 나노 및 쌍으로 가져옵니다.

밀봉 테스트는 전극 저항을 보여주며, 이는 3-7메가옴이어야 합니다. 그런 다음 밀봉 테스트 창을 닫습니다. 드롭다운 메뉴에서 Acquire open protocol을 선택합니다.

그런 다음 저장된 전압 프로토콜을 선택합니다. 여기서 선택한 프로토콜은 마이너스 100밀리볼트까지 단일 전압 단계를 제공하고 2초마다 플러스 40밀리볼트까지 증가하도록 사전 프로그래밍되었습니다. 이 램프 프로토콜을 사용하면 반전 전위와 GK 채널의 내부 정류 특성을 관찰할 수 있습니다.

전압 게이트 이온 채널의 경우, 직사각형 전압 단계는 마이크로 매니퓰레이터 접근 방식의 미세 조정을 사용하여 셀이 양압을 해제하고 셀 표면을 만진 후 약간의 음압을 적용하는 것이 더 적절할 수 있습니다. 밀봉 테스트에서 저항의 결과 증가를 모니터링합니다. 저항이 기가 옴 범위에 들어가면 전극이 멤브레인에 밀봉된 것입니다.

이를 기가 씰이라고 합니다. 주사기를 사용하여 음압 펄스를 가하여 멤브레인을 파괴하고 세포에 접근할 수 있습니다. 전체 셀 구성에 들어가면 씰 테스트는 테스트의 시작과 끝에서 스파이크 또는 과도 현상으로 볼 수 있는 큰 용량성 전류를 등록합니다.

밀봉 테스트의 펄스. 그런 다음 멤브레인 테스트 버튼을 클릭합니다. 클램프 X에서 접근 저항 멤브레인 저항을 기록합니다.

노트북의 멤브레인 커패시턴스는 눈으로 기하급수적 맞춤을 확인합니다. 멤브레인 커패시턴스는 셀 크기에 비례하며 전류 밀도 액세스를 계산하는 데 사용됩니다. 저항 및 멤브레인 저항은 녹음이 계속하기에 만족스러운지 여부를 평가하는 데 사용됩니다.

좋은 녹음은 액세스 저항이 낮습니다. 이제 멤브레인 테스트 창을 닫고 씰 테스트 창에서 씰 테스트 버튼을 다시 클릭하여 V를 마이너스 40밀리볼트로 설정하여 증폭기의 멤브레인 커패시턴스 및 직렬 저항을 보상하고, 전체 셀 캡을 켜고, 과도 상태가 최소화되고 전류가 플랫 라인이 될 때까지 전체 셀 캡과 직렬 저항을 앞뒤로 조정합니다. 필요한 경우 증폭기의 빠른 캡 손잡이로 피펫 커패시턴스를 조정하십시오.

보상이 너무 많거나 너무 적으면 잔여 용량이 일시적인 상태로 남게 됩니다. 그런 다음 백분율 예측 손잡이를 60-80%로 돌리고 필요에 따라 전체 셀 캡 직렬 저항과 빠른 캡을 다시 조정하여 밀봉 테스트에서 평평한 선을 얻습니다. 마지막으로, 셀을 진동시키지 않고 백분율 콤프를 약 100%로 전환하면서 전체 셀 캡 직렬 저항과 빠른 캡 전위차 미터를 재조정하여 펄스를 가능한 한 선형으로 유지하려고 합니다.

저항 및 커패시턴스 보상에 도달하면 ampliifier 커패시턴스 직렬 저항 퍼센트, 보상 퍼센트 예측 및 지연 시간에 대해 설정된 값을 노트북에 기록하고 제어 20K 수조 솔루션에 대한 외부 솔루션 밸브를 켭니다. 앰프의 저역 통과 용기 필터를 2킬로헤르츠로 설정합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 녹음 버튼을 클릭하여 전류 녹음을 시작합니다.

ger current의 내부 정류 특성을 찾으십시오. 이것은 nert 방정식 EK에 의해 결정되는 칼륨 반전 전위에 대한 큰 내부 전류 음수와 ek에 대해 양수 작은 외부 전류로 간주됩니다. 안정적인 기준선을 기록한 후, 세포외 용액 20k plus carbahol을 적용하여 전류의 수용체 매개 활성화를 결정합니다.

피크 활성화가 관찰되고 전류가 정상 상태에 도달하면 K 수조 솔루션으로 다시 전환하고 기준선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 다음으로 gert currents의 알코올 활성화를 연구합니다. 외부 용액 20k 플러스 100밀리몰 에탄올로 전환하고 최대 응답을 기다립니다.

그런 다음 20K 수조 용액으로 다시 전환하고 기준선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 마지막으로, 기초 거트 전류를 확인하려면 20K 플러스 20K 바륨 용액으로 전환하고 여기에서 응답을 기다립니다. gerk current의 억제는 시술 전반에 걸쳐 영하 100m볼트에서 가장 두드러집니다.

다양한 extracellular solutions의 적용에 해당하는 trace sweep number를 주목하십시오. 단일 클램프 맞춤 파일에는 전체 실험에 대한 모든 스윕이 포함됩니다. GK 데이터를 분석하려면 클램프 FIT 8.2 소프트웨어를 사용하십시오.

동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따르면, 야생형 또는 돌연변이 GK 채널을 발현하는 HEC 2 9 3 T 세포에서 두 가지 다른 도매 기록을 얻었고 야생형 GK 2에 대해 여기에 표시된 것처럼 이 비디오의 지침에 따라 분석했습니다. 왼쪽 패널에는 서로 다른 솔루션이 있는 경우 전압 램프 프로토콜에 의해 생성된 여러 중첩 전류가 있는 창이 있습니다. 내적 정류에 주목하십시오.

이는 전류 트레이스에서 약 50밀리초 동안 마이너스 100밀리볼트에서 더 큰 내부 전류입니다. 전류 트레이스에서 약 200-260 밀리 초의 0에서 40 밀리 볼트 사이의 작은 외부 전류는 내인성 전압 게이트 게이터 칼륨 채널에서 발생합니다. Gert 현재 커서가 아닙니다.

하나는 최대 내부 전류 위에 배치되고 커서 값은 스프레드시트에 기록됩니다. 스프레드시트에서. 마이너스 100 밀리 볼트의 트레이스 수와 전류가 보입니다.

데이터에는 기저 전류, 카르바홀 유도 및 알코올 유발 전류, 바륨 억제 전류가 포함됩니다. 마찬가지로, 전압 램프 전류는 다른 솔루션이 있는 경우 발생합니다. 돌연변이 채널 L 2 57 w에 대해 20 k 플러스 100 밀리몰 에탄올 또는 20 k 플러스 5 밀리몰 카바홀 또는 20 k 플러스 바륨이 표시됩니다.

현저히 더 작은 알코올 및 탄수화물 알코올 유도 전류에 주목하십시오. 이러한 발견은 이 잔류물이 알코올 및 g 베타 감마 소단위체에 의한 GK 채널의 게이팅에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고급 전기생리학 기술을 사용하여 채널 기능에 대한 돌연변이를 구성하고 연구하고 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 마스터되면, 이 부위에 지시된 신생생 기술은 2-3일 안에 완료할 수 있으며 최대 5개 이상의 돌연변이까지 확장할 수 있습니다. 이러한 기술의 개발은 이온 채널 생물물리학자들이 이온 채널 기능과 게이팅의 기본 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 또한 연구자들은 이온 채널 유전자의 단일 돌연변이로 인해 발생하는 인간 질병을 연구할 수 있습니다.