Procédé de préparation d’échantillons pour visualiser des bactéries formant un biofilm sur des hyphes fongiques

Introduire une colonie fongique liée à la cellophane dans une suspension bactérienne marquée par fluorescence. Retirez le cellophane et incubez.

Les cellules bactériennes adhèrent à la surface fongique via des molécules de surface et des récepteurs. Les bactéries adhérentes sécrètent des substances polymères extracellulaires composées de polysaccharides, de protéines et d’ADN, piégeant les cellules bactériennes et formant la base structurelle du biofilm.

Rincez la section dans une solution saline forte pour éliminer les bactéries faiblement liées

Dans un tampon phosphaté, coupez une section de la colonie.

Transférez la section dans de l’eau stérile contenant de l’agglutinine de germe de blé, ou WGA liée à un colorant fluorescent rouge.

Le WGA, une protéine végétale, se lie aux résidus de N-acétylglucosamine et d’acide sialique, ce qui permet au colorant attaché d’être fluorescent sur la paroi cellulaire fongique.

Rincez la section dans un tampon de phosphate.

Immergez partiellement une diapositive dans la mémoire tampon. Laissez la section flotter dessus. Soulevez doucement pour que la section se dépose sans perturber le biofilm.

Placez un support de montage, suivi d’une lamelle pour l’analyse microscopique.

Après avoir cultivé les bactéries pendant la nuit, centrifugez la culture à 5 000 fois g pendant trois minutes, puis suspendez la pastille dans 25 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium de 0,1 molaire. Après avoir répété la centrifugation, utilisez le même tampon pour ajuster la concentration bactérienne finale à 10 à neuf cellules par millilitre.

Remplissez une microplaque de 6 puits avec 5 millilitres de suspension bactérienne. À l’aide d’une lame de rasoir stérile, coupez la membrane de cellophane de la culture fongique en carrés, avec une seule colonie sur chaque membrane. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement les carrés de cellophane contenant des hyphes du milieu solide et transférez-les dans des puits individuels de la suspension bactérienne.

Secouez doucement la microplaque jusqu’à ce que les colonies fongiques se détachent de la cellophane. Ensuite, retirez les feuilles de cellophane en laissant les colonies fongiques dans la plaque. Incuber la microplaque en l’agitant doucement à 20 degrés Celsius pendant un certain temps en fonction des souches utilisées et de l’étape à analyser.

Pour P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incubez les cultures pendant 30 minutes pour obtenir des biofilms à un stade précoce et jusqu’à 16 heures pour les biofilms matures. Pour éliminer les bactéries planctoniques et les bactéries fixées électrostatiquement aux hyphes, rincez le champignon en le transférant dans une nouvelle microplaque à 6 puits remplie d’une solution saline forte. Secouez doucement l’assiette pendant 1 minute.

Transférez le champignon dans une nouvelle microplaque à 6 puits contenant 5 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium de 0,1 molaire. Secouez doucement l’assiette pendant deux minutes, puis transférez le champignon dans un tampon frais.

Tout en gardant la colonie fongique en tampon, utilisez un scalpel pour couper la colonie environ en deux. Transférez la moitié de la colonie à colorer dans une boîte de Pétri contenant 1 millilitre d’eau stérile complétée par un colorant fluorescent approprié pour visualiser le réseau fongique, tel que l’agglutinine de germe de blé conjuguée à Alexa Fluor633. Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité.

Après la coloration, rincez l’échantillon en le transférant dans un couvercle de boîte de Pétri contenant 10 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium à 0,1 molaire, et agitez doucement pendant 1 minute. Immergez à moitié une lame dans le couvercle de la boîte de Pétri et positionnez délicatement la section coupée pour qu’elle flotte au-dessus de la lame. Ensuite, soulevez lentement le côté de la solution tampon pour permettre à l’échantillon de se déposer doucement sur la lame.

L’aspect le plus délicat est le positionnement de l’échantillon sur la lame. Pour éviter la rupture du biofilm, l’échantillon et la lame doivent être immergés lors du positionnement de l’échantillon, et l’échantillon ne doit plus être déplacé avant l’imagerie.

Enfin, ajoutez 10 microlitres de produit de montage anti-évanouissement à l’échantillon et couvrez-le d’une lamelle en verre.