Photoimmunothérapie proche infrarouge pour l’élimination ciblée de cellules dans des cultures 3D mixtes

Prenez une culture de sphéroïdes mixtes en forme de goutte suspendue, qui sont des agrégats cellulaires hétérogènes composés de cellules cibles exprimant des récepteurs de facteur de croissance et une protéine fluorescente, tandis que les cellules non cibles expriment une protéine fluorescente de couleur différente.

Remplacer le milieu par un conjugué anticorps-photoabsorbeur composé d’un anticorps monoclonal spécifique à la cellule cible et d’un colorant photoabsorbant.

Incuber pour faciliter la liaison des anticorps aux récepteurs cellulaires cibles.

Lavez les sphéroïdes avec un média pour éliminer les conjugués non liés, puis transférez-les dans un plat à fond de verre avec un média pour l’irradiation lumineuse.

Exposez les sphéroïdes à la lumière proche infrarouge pour la photoimmunothérapie, déclenchant une réaction photochimique du colorant photoabsorbant sur les cellules cibles, provoquant des dommages rapides à la membrane cellulaire et la mort cellulaire.

Ce processus élimine les cellules cibles sans endommager les cellules non cibles.

Transférez les sphéroïdes dans une nouvelle assiette suspendue. Ajouter du substrat et incuber pour la croissance des sphéroïdes.

Au microscope à fluorescence, l’absence de fluorescence des cellules cibles indique une élimination efficace des cellules, tandis que la présence de fluorescence des cellules non cibles confirme le caractère sélectif de la photoimmunothérapie.

Pour préparer la culture cellulaire 3D mixte, ajoutez 1 millilitre d’eau stérile dans la section du réservoir d’une plaque de chute suspendue à 96 puits. Ensuite, mettez en plaque divers ratios des types de cellules d’intérêt dans le milieu de culture cellulaire approprié, à au moins 5000 cellules par 50 microlitres de milieu par puits, pendant 5 à 7 jours dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changez de milieu de culture tous les deux jours et observez quotidiennement la morphologie et la taille des sphéroïdes à l’aide d’un microscope à fond clair inversé à un grossissement de 10 à 40 fois. Lorsque les sphéroïdes ont atteint 400 à 600 microns de diamètre, remplacez le milieu de la plaque de chute suspendue par un milieu contenant un conjugué anticorps-photoabsorbeur, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant six heures.

À la fin de l’incubation, laver les sphéroïdes deux fois avec un milieu de culture frais sans rouge de phénol. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec une extrémité tronçonnée pour transférer un sphéroïde à la fois dans des boîtes individuelles de 50 millimètres à fond de verre contenant 100 microlitres de milieu de culture frais sans rouge de phénol par boîte. Utilisez le microscope inversé pour observer les changements dans la morphologie des sphéroïdes.

Pour irradier les sphéroïdes, placez une diode électroluminescente à moins de 5 pouces au-dessus des paraboles à fond de verre et utilisez un wattmètre optique pour confirmer l’émission d’une longueur d’onde de 670 à 710 nanomètres à deux joules par centimètre carré. Après la photo-immunothérapie dans le proche infrarouge, transférez les sphéroïdes dans une nouvelle plaque de chute suspendue avec 50 microlitres de milieu de culture frais par puits pendant une journée dans l’incubateur de culture cellulaire.

Ensuite, à l’aide d’une autre pointe de pipette de 200 microlitres avec une extrémité tronquée, transférez doucement les sphéroïdes dans de nouvelles boîtes à fond de verre contenant 100 microlitres de milieu de culture sans rouge de phénol et évaluez l’expression du rapporteur optique au microscope fluorescent. Enfin, détecter les cellules mortes par l’ajout d’iodure de propidium au milieu ou par la perte de fluorescence de la GFP cytoplasmique.