Name: La stimolazione meccanica delle cellule staminali Utilizzando ciclica deformazione uniassiale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Impara a stimolare meccanicamente le cellule staminali utilizzando deformazione ciclica uniassiale con un bioreattore personalizzato. Questo metodo permette di studiare la biologia meccanica cellulare per applicazioni in ingegneria tissutale.

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Giorno 0 - Sterilizzazione prima della data di esperimento <ol><li> Mettere i materiali in vasca di plastica e sterilizzare con alcool al 70% per 2 ore: <ul><li> Chambers </li><li> Coperchi </li><li> Cornici (tutti e 3 pezzi) </li><li> Viti </li><li> Guarnizioni in gomma </li><li> Forcipe </li><li> Forbici </li><li> Hex chiavi </li></ul></li><li> Membrane Aquet Pulire con sapone e acqua distillata. </li><li> Sonicare membrane in alcool al 70% per 10 minuti. </li><li> Posizionare le membrane pulite nella plastica piatti quadrati. Se si utilizza membrane fantasia, in modo che il lato modellato è rivolto verso l&#39;alto (alcool vaporizzare su un lato della membrana e guardare per il liquido a correre giù per i solchi). </li><li> Lascia membrane coperto di alcool al 70% per 2 ore. </li><li> Guanti pacchetto in un foglio di alluminio per la sterilizzazione in autoclave domani mattina. </li><li> Fai 2% (peso / volume) soluzione di gelatina (2g/100mL) in acqua distillata per sterilizzazione in autoclave domani. </li><li> Dopo la sterilizzazione 2 ore nel 70% di alcol, luogo tutti i materiali polimerici e membrane (non autoclavabile materiali) in cappuccio UV per una notte: <ul><li> Chambers </li><li> Coperchi </li><li> Cornici (tutti e 3 pezzi) </li><li> Membrane </li></ul></li><li> Confezione di materiali rimanenti in borsa autoclavabile: <ul><li> Viti </li><li> Guarnizioni in gomma </li><li> Forcipe </li><li> Forbici </li><li> Hex chiavi </li></ul></li></ol> Giorno 1 - Assemblea delle Camere tratto <ol><li> Autoclave pinze, forbici, chiavi esagonali, viti, guarnizioni, guanti, e gelatina con autoclave piccoli a 240 ° C per 20 minuti totali </li><li> Rimuovere le membrane da raggi UV e trattare con O 2 al plasma (lato fantasia verso l&#39;alto) per ~ 1 minuto. </li><li> Nel cofano TC, coprono un&#39;area modellata su membrane plasmatiche trattate con gelatina. Cappotto 30 per minuti sotto UV. </li><li> Lavare ogni membrana con PBS 2X. Dopo il lavaggio 2 °, lasciare un po &#39;PBS sulle membrane per tenerli scivoloso, per facilitare il montaggio nelle camere. (Se anche utilizzare questa PBS per lubrificare le guarnizioni per facilitare il montaggio). </li><li> Montare le membrane in camere (indossare guanti sterilizzati in autoclave in fase di montaggio) <ol><li> Collegare i due pezzi principali del telaio con una sola vite. </li><li> Capovolgere il telaio su una membrana e posto sulla parte superiore in modo che la gelatina rivestite facce laterali verso il telaio (l&#39;area modellata dovrebbe essere al centro). </li><li> Fissare la membrana al telaio tramite una guarnizione per ogni lato. </li><li> Premere il guarnizioni, con dolce, anche la pressione, per non strappare la membrana. </li></ol></li><li> Fissare telaio assemblato a T-bar. </li><li> Capovolgere il telaio e posto in camera a testa in giù. UV retro del telaio e della membrana per 30 minuti </li><li> Capovolgere il telaio nuovo, e vite in camere (nessun cambiamento per camera di controllo, ma per il tratto da camera, necessità di utilizzare due viti per fissare il pezzo finale del telaio per il fondo della camera, e la necessità di rimuovere la vite che è tenendo i due pezzi del telaio insieme). Laterali anteriori UV per 30 min. Assicurarsi che le membrane sono completamente asciutti prima di procedere alla fase successiva, oppure la soluzione cella può scivolare durante la semina. </li><li> Semi di cellule. Superficie di 1 = Area piastra di 3 membrane, in modo da usare 1 / 3 di un piatto confluenti per membrana. Usare 1 ml di soluzione per cella a membrana. Non più di 1,5 ml sarà difficile tenere soluzione su. Mettere soluzione cellula solo su un&#39;area modellata, e usare la punta della pipetta per diffondere la soluzione in giro. Coprire e lasciare che le cellule camere di attaccare per 30 minuti RT nel cappuccio. </li><li> Spostare camere di un&#39;incubatrice e lasciare che le cellule allegare per 1 ora di più. Essere molto attenti in movimento le camere per evitare di lasciare soluzione cellula scivolare! Le cellule in quella camera si rovina se la soluzione cade a questo punto. </li><li> Ritorna alla camera di cappuccio e aggiungere 20 ml multimediali. </li><li> Camere posto in alcool-pulito vasca che è coperto con un foglio di alluminio (anche spruzzato con l&#39;alcol). Spostare camere per allungare incubatore (10% di CO 2). </li><li> Camere di sicuro in macchina stretch. Lasciate che altre cellule allegare tutta la notte, e iniziare a allungare il giorno successivo. (Nota: quando mettono camere in macchina tratto, ricordarsi di bloccare la macchina in posizione &quot;zero&quot; prima di piazzare le camere, e quindi stringere l&#39;elastico intorno al ingranaggi Non dimenticare di sbloccare gli ingranaggi prima di avviare la macchina.). </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes et al. prima riportato l&#39;uso di un sistema di stimolazione meccanica delle cellule in vitro, utilizzando un substrato flessibile elastomerico per fornire forza meccanica alle cellule 1. Da allora, molte varianti di questo disegno sono stati concepiti e utilizzati. Diversi sistemi meccanici tratto sono disponibili in commercio sotto il nome &quot;Flexercell&quot; (Flexcell International Corp.), mentre alcuni laboratori utilizzano custom-built dispositivi. In questo protocollo video che abbiamo descritto la configurazione...

Note sui media: questi esperimenti si estendono uniassiale sono inclini alla contaminazione a causa della complessità di configurazione bioreattore. Per combattere questo, abbiamo provato varie combinazioni di antibiotici e agenti antifungini. Il Fungizone 1% di solito necessario, insieme ad una combinazione di antibiotici. Utilizzare una Pen / Strep combinazione, o utilizzare una combinazione di kanamicina e Gentamicina (ma NON provare a utilizzare una combinazione / cocktail di tre o più antibiotici insieme, come si può portare a batteri resistenti agli mutante, e può anche essere dannosa per le cellule) .

la stimolazione meccanica delle cellule staminali utilizzando ciclica deformazione uniassiale

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

Il ruolo delle forze meccaniche per lo sviluppo e il mantenimento dei tessuti biologici è ben documentata, tra cui diversi fenomeni meccanicamente regolamentati quali il rimodellamento osseo, ipertrofia muscolare e plasticità delle cellule muscolari lisce. Tuttavia, le forze in gioco sono spesso estremamente complessi e difficili da monitorare e controllare in vivo. Per meglio studiare gli effetti di forze meccaniche sulle cellule, abbiamo sviluppato un metodo in vitro per l&#39;applicazione di tensione uniassiale di trazione ciclica di cellule aderenti coltivati ​​su membrane elastiche. Questo metodo utilizza un design personalizzato bioreattore con un cam-rotore sistema motorizzato di applicare la forza desiderata. Qui vi presentiamo uno step-by-step protocollo video che dimostrano come assemblare i vari componenti di ogni &quot;camera stretch&quot;, tra cui, in questo caso, una membrana di silicone con topografia micropatterned di orientare le cellule con la direzione del ceppo. Abbiamo anche descrivere le procedure per la sterilizzazione delle camere, semina sulla membrana delle cellule, la camera di blocco nel bioreattore, e regolando i parametri meccanici (per esempio grandezza e la velocità di deformazione). Le procedure descritte in questo particolare protocollo sono specifici per la semina cellule staminali mesenchimali su membrane di silicone con 10 canali micron gamma orientati parallelamente alla direzione di deformazione. Tuttavia, i metodi e materiali presentati in questo sistema sono abbastanza flessibili per accogliere una serie di variazioni su questo tema: velocità di deformazione, grandezza, durata, tipo di cellula, topografia membrana, membrana di rivestimento, ecc possono essere personalizzati per l&#39;applicazione desiderata o esito. Questo è un metodo affidabile per lo studio degli effetti di deformazione a trazione uniassiale applicata alle cellule in vitro.

E &#39;ampiamente compreso che le forze meccaniche nel corpo può influenzare la differenziazione e proliferazione cellulare. Qui vi presentiamo un protocollo di video che illustra l&#39;uso di una custom-built bioreattore per la distribuzione di tensione uniassiale di trazione ciclica alle cellule staminali coltivate su substrati flessibili micropatterned.

La stimolazione meccanica delle cellule staminali Utilizzando ciclica deformazione uniassiale

Il ruolo delle forze meccaniche nello sviluppo e nel mantenimento dei tessuti biologici è ben documentato, inclusi diversi processi regolati meccanicamente...

Ciao, sono Song Li. Sono professore associato del Dipartimento di Bioingegneria all'Università della California, Berkeley. E io sono Kyle Kapinsky. Sono un dottorando nel campo della bioingegneria presso l'Università della California, Berkeley.Oggi presenteremo un protocollo per la stimolazione meccanica di cellule staminali mediante deformazione ciclica UNI assiale. La ricerca nel nostro laboratorio si concentra sull'ingegneria cellulare e tissutale, in particolare nel sistema cardiovascolare. Siamo interessati alla biologia meccanica delle cellule staminali poiché esistono alcune potenziali applicazioni.Uno riguarda il desiderio di comprendere l'effetto dei fattori meccanici sullo sviluppo, ad esempio sullo sviluppo embrionale. Due, siamo interessati al controllo della differenziazione delle cellule staminali in vitro o in un reattore intestinale. E terzo, siamo interessati al modo in cui le cellule staminali rispondono ai fattori meccanici cardiovascolari in vivo, ad esempio dopo il trapianto.Pertanto, per studiare tutti questi aspetti, disponiamo di un bioreattore appositamente progettato in cui possiamo seminare cellule su membrane elastiche e successivamente stirare tali memb

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Biologia

La biosintesi di matrice extracellulare cartilaginea dai condrociti può essere influenzata da applicazione di stimoli meccanici. Questo metodo descrive la tecnica di applicazione di compressione dinamiche ceppi di condrociti incapsulati in costrutti 3D e la valutazione dei cambiamenti indotti nel metabolismo dei condrociti.

La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

Questo manoscritto presenta una tecnica per applicare o liberare forze su cellule o tessuti aderenti usando allungamento unidirezionale.

Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici.

Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l'allineamento di cella per l'ingegneria tissutale.

Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

Qui presentiamo un protocollo per la formazione di una popolazione delle cellule usando stimoli elettrici e meccanici, emulando la fisiologia cardiaca. Questa stimolazione elettromeccanica migliora il potenziale di cardiomiogenici delle cellule trattate ed è una strategia promettente per ulteriore terapia cellulare, la modellazione di malattia e lo screening di stupefacenti.

Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale è un bioreattore ideale per la differenziazione tenogenica-specifica delle cellule staminali derivate dal tendine e della formazione neo-tendina.

Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon

Questo articolo descrive una procedura per produrre iTenociti generando cellule stromali mesenchimali derivate da iPSC con sovraespressione combinata di Scleraxis utilizzando un vettore lentivirale e stretching uniassiale tramite un bioreattore 2D.

Generazione di itenociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte tramite sovraespressione combinata della sclerassi e tensione uniassiale 2D

Qui presentiamo un dispositivo innovativo che applica forme d'onda di deformazione isotrope e uniassiali alle cellule, supportando al contempo la coltura su substrati con rigidità sintonizzabile e matrici proteiche personalizzabili. Questa piattaforma semplice ed economica consente ai ricercatori di indagare come i segnali meccanici regoli la funzione cellulare sia in studi fondamentali che in contesti rilevanti per la malattia.

Una piattaforma innovativa per lo stretching e l'imaging cellulare in vitro

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Impara a stimolare meccanicamente le cellule staminali utilizzando deformazione ciclica uniassiale con un bioreattore personalizzato. Questo metodo permette di studiare la biologia meccanica cellulare per applicazioni in ingegneria tissutale.

La stimolazione meccanica delle cellule staminali Utilizzando ciclica deformazione uniassiale

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