スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

この手順の全体的な目標は、トランスジェニックマウスから超マチック核をスライスして解剖する方法を示し、回路図組織を培養して、時計遺伝子またはタンパク質の発現を発光によって誘導されるルシフェラーゼとして記録する方法を実証することです。これは、まず、時計遺伝子またはタンパク質のルシフェラーゼレポーターを含むトランスジェニックマウスから脳を解剖し、次に超マチック核を含む脳スライスを作成することによって達成されます。手順の2番目のステップは、スライスから小さな両側の概略核を解剖することです。

手順の3番目のステップは、培養、培地、およびルシフェリアンを含むペトリ皿の膜上で概略的な核の説明を培養することです。手順の最後のステップは、光気密加熱チャンバー内で光電子増倍管を使用して生物発光を測定することにより、ルシフェラーゼ活性を記録することです。最終的には、時計遺伝子またはタンパク質の概日振動を選択した結果を得ることができます。

私の名前はセルゲイIVで、ガブリエル再クラブで働いています。私の名前はSoFiヨハンソンで、ガブリエラのチームで働いています。私の名前はガブリエル・クイストです。

私は神経科学部門の主任研究者であり、私の名前はKa LaShonで、スウェーデン医学神経科学センターの博士課程の学生であり、ガブリエラと協力しています。この手法は、ウェスタンブロットR-T-P-C-Rのような既存の方法や、2つのハイブリダイゼーションと比較した場合の主な利点は、時計遺伝子またはタンパク質の発現を同じ組織内で何日も連続して追跡でき、約1分間の非常に高い分解能で追跡できるため、周期の振幅と概日リズムの顔を詳細に分析できることです。この方法は、SENのスライスと解剖のステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

SENは非常に小さいため、識別が難しい場合があります。その手順を実演するのは、私の研究チームのポスドク研究員であるSge Velia博士です。必要な溶液を作成した後、オートクレーブ真空グリースをあらかじめ充填した5ミリリットルのシリンジを使用して、実験で使用するペトリ皿を準備します。

35mmのシャーレの上部リング面にグリースを塗布します。スライスごとに別々のシャーレを準備します。文化。ファルコンチューブに10ミリリットルの空気、緩衝培地を入れます。

これにより、8つの文化に十分な媒体が得られます。解凍したてのルシフェリアンを10マイクロリットル加えます。ルシフェリアンは光に敏感なので、ファルコンチューブを摂氏37度の暗い加熱チャンバーに保管して、ルシフェリアン培地を光から保護します。

次に、手順で使用するすべての器具、カバーグラス、その他の材料を滅菌します。すべての非滅菌機器に70%エタノールをスプレーします。.器具と油を塗ったペトリ皿を滅菌フード内で少なくとも30分間UVにさらします。

別の準備ステップは、ビブラートをセットアップし、滅菌カミソリの刃を取り付けることです。これで、外科手術のための機器がセットアップされました。マウスに麻酔をかけ、首を切った後、ハサミで頭から目を取り除きます。

これにより、視神経のトレーニングや興奮が防止され、回路図核またはSCNの損傷を回避できます。細いハサミを使って最後の頸椎を取り除き、皮膚を取り除きます。頭蓋骨の両側に沿って頭蓋骨に2つの切り込みを入れ、取り外し可能な蓋を作ります。

マイクロのRon Jreツールで頭蓋骨を開きます。ツールで脳を圧迫しないで、上向きの動きでRJを使用してください。甘やかしSCNの損傷を防ぐために、嗅球が見えるまですべての骨を取り除きます。

微細なマイクロ解剖スプリングハサミを使用して、半球と嗅球の間の視神経を慎重に切り取ります。お願いします。マウスの頭の下に50〜100ミリリットルの冷たいHBSSを詰めたペトリ皿。頭を逆さまにして、無傷の脳が抜け始めるのを待ちます。

必要に応じて、視神経とは反対側で他の脳神経を切断します。切り離されると、脳はペトリ皿に落ち、脳が急速に冷やされます。スプーンを使用して、氷のように冷えた脳を、ガラスのペトリ皿の蓋を逆さまにしたような滅菌済みの切断面に移します。

半球と小脳の間に滅菌のかみそりの刃で垂直に切り込みを入れて、小脳を取り除きます。バイオムの乾燥プラットフォームに瞬間接着剤を塗布します。脳の吻側部分に鋭く湾曲した鉗子を挿入し、鉗子で脳を保持している脳を拾い上げます。

滅菌濾紙でHBSSを慎重に乾かします。吻側の先端を上にし、腹側表面をカッティングブレードに最も近い状態で、半球をプラットフォームの接着剤に固定します。プラットフォームをビブラートホルダーに取り付け、すぐに冷たいHBSSで満たします。

垂直カットが適切に行われると、半球はまっすぐ上に立つはずです。目標は、ビブラートの最高速度を使用して、両側SCNの中央領域を含む冠状スライスを切断することです。交連に達するまで、半球の厚さ500〜800マイクロメートルの部分を切り取り始めます。時計。

視交叉が広くなるにつれて、セクションが100マイクロメートルの厚さに減少すると、コドル方向にスライスを続け、ブレードの水平方向の手動移動を遅くして、2つのSCN核が現れ始めます。必要に応じて虫眼鏡を使用して、SCNのレベルに達したときの原子核を視覚化します。250マイクロメートルのSCNセクションをカットします。

中型のシャーレの蓋に、柔らかいブラシを使用して冷たいHBSSを入れます。SCN脳切片を持ち上げてペトリ皿に移します。ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置きます。

次のステップは、スライスからSCNを解剖することです。顕微鏡を使用して、両側のSCNが切片の少なくとも片側にはっきりと見えることを確認します。滅菌メスのペアを使用して、両方のSCNを含む両側に約1.5ミリメートルの正方形の組織を解剖します。

できるだけSCNに近づけてカットします。SCN組織を除去せずに、視神経の小片を説明に付着させる必要がありますが、他の核は含めないでください。両側性SCNを含む組織を半分に切開して、2つの片側性SCNを取得します。

片側1つのSCNを滅菌フードのコントロールとして使用できます。ライトを消した状態で、直径35mmのシャーレに1200マイクロリットルのルシファー培地を加え、液面の上に培養膜を置きます。メンブレンの下に気泡がないことを確認してください。

インプラントは小さく、拾い上げるのが難しいです。したがって、先端付きの1000マイクロリットルピペットを使用して、SENエクスプランを先端に吸い込み、培養膜に押し出します。ルシフェラーゼ記録のために余分なHBSSを破棄し、ペトリ皿ごとに1つのSENのみを配置します。

グリースペトリ皿を直径40mmのカバーガラスで密封します。シールがきつく締まっていない場合は、グリースを追加します。ペトリ皿を摂氏36〜37度の光密加熱室に置かれたアルミサイクル装置に移します。

培養を開始するには、ラムサイクルチャンバー内に取り付けられた培養皿と光電子増倍管検出器アセンブリに注目してください。培養皿を光電子増倍管の下に約1〜2cm置きます。光電子増倍管は、発光によって誘導されるルシフェラーゼを検出し、増幅します。

データ取得には、Luma Cycleソフトウェアツールを使用します。光子カウントは、遺伝子タンパク質発現の高解像度を得るために、1〜10分間隔で統合されます。遺伝子タンパク質の概日発現を解析し、リズムの位相周期と振幅を決定します。

この図は、健康なSCN組織培養と非健康なSCN組織培養からの生物発光記録を示しています。これらのマウスは、SCN組織を採取する前に、12時間明るい場所で、12時間暗い場所で保持されました。黒線は、周期2のルシフェラーゼ発現の生物発光記録の概日リズムを示しています。

健康なSENスライスでは、タンパク質は概日変動で振動し、タンパク質の最大発現はゼゲーバー時間、12〜13、または暗闇の始まりで発生します。したがって、遺伝子リズムの位相は、動物が犠牲の前に飼われていた明暗のスケジュールに依存します。青い線は、矢印で示されている4日目に培養皿を開封し、適切に再密封しなかったために乾燥したSEおよび培養物からの生物発光記録を示しています。

赤い線は、健康でないSCN培養物からの生物発光記録を示しています。この図は、薬理学的実験でSCN培養物を使用しています。この図は、最初の矢印で示された時間にHCNイオンチャネルブロッカーで処理された培養物からのトレースを示しています。

2〜3日かけて、イオンチャネルブロッカーは減少し、2本目の矢印で概日振動を停止しました。この処置を試みている間、薬物を洗い流し、条件付けされたコントロールメディウムに置き換えました。SEN組織を生存可能に保つためには、迅速かつ慎重に作業することを忘れないことが重要です。

また、ビブラムセクショニングを標準化して、毎回同じレベルのSENが得られるようにすることも重要です。このビデオを見れば、通常は膜上でSCN器官であるSEN培養物をスライスして解剖し、培養物中の発光によって誘導されるルシフェラーゼとしての時計遺伝子またはタンパク質の発現をモニターする方法を十分に理解できるはずです。