Name: 传统美国宇航局后肢卸小鼠模型的一个交替的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解一种简化的小鼠后肢卸荷新方法，通过尾环植入技术有效诱导肌肉萎缩，同时保持动物稳定体重和整体健康。该方法为研究肌肉骨骼生理学和太空生物学提供了可靠的替代方案。

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作者谨此感谢本实验室出色的本科研究学生 Andrew J Dunn 在技术协助及动物护理方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院基金 HD058834 和密苏里大学生命科学奖学金资助。

术前器械/材料
<ul>
<li>剪线钳/镊子</li>
<li>2 英寸 × 2 英寸纱布垫</li>
<li>加热垫</li>
<li>硝酸银棒</li>
<li>无菌外科手套</li>
<li>异氟烷吸入麻醉剂</li>
<li>4% 葡萄糖酸氯己定（抗菌外科洗手液）</li>
<li>无菌 2-0 外科不锈钢缝线</li>
<li>25 × 5/8 英寸 A 型针头（已高压灭菌）</li>
<li>止血钳（已高压灭菌）</li>
<li>外科不锈钢缝线</li>
</ul>
手术操作步骤
<ol>
<li>创建无菌区域。遵循无菌操作规程。</li>
<li>使用 2 - 3% 异氟烷麻醉小鼠。</li>
<li>将小鼠置于加热垫上。</li>
<li>用氯己定溶液擦洗尾部。</li>
<li>定位 5、6 或 7th 椎间间隙（位于尾部两个骨性突起之间，从体毛末端开始计数，位于尾部基部）。</li>
<li>使用止血钳和25G针头在两个椎骨之间的椎间空间钻出导向孔。</li>
<li>使用钢丝剪将钢丝缝线剪成10 cm长。</li>
<li>移除针头，将钢制缝合线穿过孔洞，使尾部两端各留出5 cm缝合线。</li>
<li>尾部两侧应各留出 +5 cm 的缝线。</li>
<li>将拇指尖放在尾部。</li>
<li>用空着的手将钢线缝合线缠绕在拇指尖端，并扭转末端形成一个大环。缠绕或环状部分的长度应为+3 mm。</li>
<li>移除你的拇指。</li>
<li>用止血钳夹住缝合线的一股，并将其弯成一个较小的环，该环的末端应尽可能靠近原始大环上的扭结处。</li>
<li>剪去多余的导线，并将绞合的导线向后弯折。</li>
<li>如果有任何过量出血，可以使用硝酸银棒止血。</li>
<li>关闭异氟烷，将小鼠单独置于饲养笼中恢复5-7天，然后再进行后肢悬吊。若多只小鼠共同饲养，尾环可能发生缠绕。</li>
</ol>
1. 后肢悬吊操作步骤

材料
<ul>
<li>10-24 号 X 4 机器螺钉，每只动物各一个。</li>
<li>尼龙锁紧螺母，10-24 号，每只动物各一个。</li>
<li>翼形螺母，10 号 X 24，每只动物两个。</li>
<li>垫圈，¼ 英寸 X 1 英寸，每只动物两个。</li>
<li>带扣钩的渔用转环，#6 号，1-11/16 英寸，每只动物一个。</li>
<li>金属缝纫机梭芯，每只动物一个。</li>
<li>小型回形针用于制作 S 形钩，每只动物一个。</li>
<li>钳子。</li>
<li>2 英寸 × 2 英寸纱布。</li>
<li>2 英寸黑色纸质文件夹夹子。</li>
<li>胶带/实验室胶带。</li>
<li>1-3/8 英寸镀层开槽钢条，长度略长于笼子的全长。</li>
<li>50 cm × 40 cm × 20 cm 的笼子（大鼠笼）。</li>
<li>带弯曲管的饮水瓶。</li>
<li>不锈钢丝，U 形，用于支撑饮水瓶。</li>
</ul>
笼具设置
<ol>
<li>将1-38英寸带槽镀锌钢条放置在笼子顶部，并用 duct tape 暂时固定。</li>
<li>将一个翼形螺母拧到机用螺钉上，套入一个垫圈，然后将机用螺钉穿过带槽钢条，位置距笼子边缘约±15 cm处。</li>
<li>再添加一个垫圈和翼形螺母。拧紧两个翼形螺母，但不要完全拧死，以便后续进行调整。</li>
<li>将机用螺钉穿过线轴中心的孔。</li>
<li>为防止线轴脱落，将尼龙锁紧螺母拧在机用螺钉的末端。线轴应能自由旋转。</li>
<li>将鱼线转环的弹簧钩穿过线轴的下部。</li>
<li>使用钳子将回形针弯成S形钩。（从回形针上截取2 cm制成钩状。）</li>
<li>将S形钩的一端穿过鱼线转环的孔，再用钳子将其夹紧闭合。</li>
<li>将U形金属丝平行于机用螺钉放置在笼子内侧，并将两端向后弯曲，以支撑装满水的水瓶。</li>
<li>将水瓶插入U形金属丝中，出水口朝下，但不接触笼底。</li>
<li>将2英寸文件夹夹打开，使其无法完全闭合。保持适当张力，刚好可夹住3至4块饲料而不掉落。这样可避免夹子的压力压碎饲料或夹到小鼠鼻部。</li>
<li>将3至4块啮齿类动物饲料放入文件夹夹中。</li>
</ol>
小鼠后肢去负荷
<ol>
<li>将S形钩的开口端穿过尾环的小环。</li>
<li>通过拧紧或松开机器螺钉上的下部翼形螺母来调节小鼠的高度，使其后肢不承受体重。达到理想高度后，拧紧上部翼形螺母。</li>
<li>重新放置水瓶和U形金属丝，防止小鼠用后肢攀爬到出水口上。使用Duct胶带将水瓶固定在笼子侧面。</li>
<li>将装有饲料的活页夹置于笼子底部，防止小鼠攀爬其上，并用Duct胶带将其固定。</li>
<li>若在同一笼子的另一侧还需对多只动物实施后肢去负荷处理，请重复相同操作。每笼饲养两只动物，动物之间应保持适当距离，使其几乎可以相互接触。</li>
<li>使用一块2×2的纱布将小鼠尾巴松松地缠绕固定在转环上。用一小段胶带缠绕纱布，以将纱布固定在尾巴上。此步骤至关重要，可防止尾巴下垂，避免尾尖血液淤积导致坏死。</li>
<li>在笼内添加少量玉米芯垫料。不要添加过多垫料，否则小鼠会堆成小丘并试图将后肢置于垫料上承重。</li>
</ol>
2. 典型结果：

为了评估尾环悬吊（HU）技术的成功效果，我们测量了各组动物在尾环手术前、悬吊前及悬吊后和恢复期的体重、比目鱼肌质量以及肾上腺质量。
小鼠在整个实验过程中的体重变化如图1所示。尾环手术前的小鼠体重（24.7 ± 3.5 g）与尾环手术后恢复5天、悬吊前的体重（24.3 ± 2.9 g）相比，差异无统计学意义。在悬吊14天后（22.7 ± 1.9 g）、28天后（21.3 ± 2.1 g）或悬吊结束后恢复3天时（24.0 ± 1.8 g），体重也未出现显著下降。尽管经过14天和28天的悬吊处理导致了轻微的体重减少（分别为-6.8%和12%），但均无统计学显著性；小鼠在悬吊后恢复3天即可完全恢复至悬吊前的体重水平。自由活动对照组小鼠与悬吊组小鼠的食物摄入量如图3所示。在28天实验期间，悬吊组小鼠的平均每日食物摄入量与对照组相比无显著差异。
我们观察到，尾部悬吊（HU）14天和28天后，比目鱼肌出现显著萎缩（分别减少39.1%和46.6%），表明悬吊操作有效（图2）。此外，该程度的萎缩与文献报道的2至4周悬吊所预期的数值一致2, 7, 8。悬吊后经过3天恢复，比目鱼肌质量显著回升至对照组的74%。恢复组的比目鱼肌质量显著高于两个悬吊组，但仍显著低于自由活动的对照组动物。
以肾上腺重量作为动物应激的指标；切除左右两侧肾上腺并称重。在所有组别中，对照组和悬吊小鼠的平均重量相当（图4）。
此前在大鼠实验中，我们采用Morey-Holton技术发现，开始进行悬吊（HU）的动物数量与完成整个悬吊过程而未从悬吊装置中脱落（因动物咬断尾部牵引胶带所致）的动物数量相比，成功率为12只中有10只1。本研究中的所有小鼠（n=54）均未在悬吊期结束前从装置中脱落。然而，有1只小鼠出现了严重的尾部炎症。当炎症表现明显时，我们取下了尾环以使炎症区域得以愈合，随后重新安装另一个尾环，以完成剩余的悬吊周期。
过去使用Morey-Holton吊尾法（HU）时，我们通常需要剔除每组1-2只小鼠，因为它们会从悬吊装置中脱出。而采用牵引环法后，在14天或28天的悬吊期间，未发生任何小鼠意外脱离悬吊装置的情况（共54只小鼠）。
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig1.jpg" alt="比较不同体重组的柱状图；统计分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 体重变化（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；Pre-HU：所有小鼠在尾部悬吊前（n=54）；HU14：尾部悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：尾部悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：尾部悬吊后允许在笼内恢复3天的小鼠（n=22）。各组间体重未观察到显著差异。
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig2.jpg" alt="比较不同条件下比目鱼肌质量的柱状图：CON、HU14、HU28、REC；研究数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 比目鱼肌萎缩情况（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；HU14：后肢悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：后肢悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：后肢悬吊后在笼中恢复3天的小鼠（n=22）。*与负重对照组（CON）相比差异显著（p&lt;0.001）。δ与两个HU组相比差异显著（p&lt;0.01）。
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig3.jpg" alt="比较对照组与后肢悬吊组每日食物摄入量（克/天）的柱状图；营养学研究结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 食物消耗量（均值 ± 标准差）。在负重状态和后肢悬吊期间的平均每日食物摄入量（g/day）。缩写：负重对照组小鼠（n=76）；HU：后肢悬吊小鼠，14–28天。CON组与HU组之间未观察到显著差异。
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig4.jpg" alt="条形图显示肾上腺质量比较；分组：CON、HU14、HU28、REC；方差分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 肾上腺质量（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；HU14：后肢悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：后肢悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：后肢悬吊后在笼中恢复3天的小鼠（n=22）。各组之间未观察到显著差异。

<ol><li>Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+hindlimb+unweighting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravitational+Physiol%22%5BJournal%5D)">An alternative method for hindlimb unweighting.</a> J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).</li>
<li>Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+disuse%3A+a+comparison+of+hindlimb+suspension+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization.</a> J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).</li>
<li>Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+transients+in+mouse+soleus+muscle+after+hindlimb+unloading+and+reloading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading.</a> Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).</li>
<li>Morey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+and+bone+turnover%3A+correlation+with+a+new+rat+model+of+weightlessness%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness.</a> BioScience. 29, 168-172 (1979).</li>
<li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindlimb+unloading+of+growing+rats%3A+a+model+for+predicting+skeletal+changes+during+space+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.</a> Bone. 22, 83-88 (1998).</li>
<li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindlimb+unloading+rodent+model%3A+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hindlimb unloading rodent model: technical aspects.</a> J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).</li>
<li>Thomason, D. B., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophy+of+the+soleus+muscle+by+hindlimb+unweighting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting.</a> J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).</li>
<li>Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+soleus+muscle+myosin+expression+during+hindlimb+suspension+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery.</a> J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们评估了一种后肢去负荷小鼠的替代方法，发现该方法效果非常理想。本文所述的尾环法可用于长期后肢悬吊以及悬吊后恢复过程的研究。在上述各种条件下，小鼠均未出现适应失败的迹象，表现为食物摄入量、体重和肾上腺重量均保持稳定。这种尾环式后肢去负荷技术操作简便，几乎无需外科手术训练即可快速掌握并应用。
与传统的 Morey-Holton5, 6方法相比，尾环法具有多项优势。首先，尾部皮肤及环状装置植入部位始终可见，因此一旦出现问题可立即发现，而不仅限于悬吊期结束时才能察觉。其次，在头低位悬吊（HU）期间，动物无法随时脱离悬吊装置，从而避免了需判断是否应将某只小鼠保留在数据集中的问题。此外，小鼠不会干扰环状装置，且在结束 HU 恢复活动后也不会抓挠或损伤尾部，使 HU 后的恢复阶段得以顺利进行。最后，采用尾环法进行后肢去负荷的小鼠，其体重维持优于使用 Morey-Holton 尾部牵引技术去负荷的小鼠。在我们的实验中，经过 14 天 HU 后，小鼠仅出现轻微（-6.8%）且无统计学意义的体重下降；而 Ingalls 等通过 Morey-Holton 方法进行 14 天 HU 后，观察到小鼠体重显著下降了 12%3。尽管 Ingalls 未报告肾上腺重量数据，但我们的结果显示，尾环法对小鼠造成的应激更小（HU 小鼠的肾上腺重量与对照组无差异），并在整个后肢去负荷期间更好地维持了体重。
综上所述，我们建立并测试了一种采用尾环法进行后肢悬吊的小鼠模型，分别实施了14天和28天的后肢悬吊，并在悬吊后恢复笼内饲养3天。根据肾上腺重量、体重及摄食量的分析结果，小鼠对尾环装置表现出良好的适应性。尾环法后肢悬吊技术是一种有效且简便的方法，可作为传统Morey-Holton后肢悬吊技术的替代方案。

<table><tbody><tr><td>剪线钳/钳子</td><td>Ace Hardware</td><td>84-056</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-901</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td>Z-1228-001</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银涂抹器</td><td>ARZOL</td><td>0001-2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Novaplus</td><td>NDC 0409-3292-49</td><td></td></tr><tr><td>4% 葡萄糖酸氯己定</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-200-01</td><td></td></tr><tr><td>无菌2-0号外科不锈钢缝合线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>SS-28</td><td></td></tr><tr><td>25号×5/8英寸针头</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>NN 2516R</td><td></td></tr><tr><td>止血钳/持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>10-24×4号机制螺钉</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>90272</td><td></td></tr><tr><td>尼龙锁紧螺母，10×24号</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>180141</td><td></td></tr><tr><td>翼形螺母，10×24号</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>180243</td><td></td></tr><tr><td>挡圈垫片，&amp;#188;×1英寸</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>290012</td><td></td></tr><tr><td>带扣钩的鱼钩转环，#6号，1-11/16&amp;#8221;</td><td>Bass Pro Shop</td><td>38-481-554-01</td><td></td></tr><tr><td>金属缝纫机梭芯</td><td>Singer Instruments</td><td>45785</td><td></td></tr><tr><td>回形针</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;#8221;黑色纸质文件夹夹具</td><td>Office Depot</td><td>308957</td><td></td></tr><tr><td>Scotch多功能 duct 胶带</td><td>Office Depot</td><td>790710</td><td></td></tr><tr><td>1-3/8&amp;#8221;镀层开槽钢条</td><td>Home Depot</td><td>548932</td><td>略长于笼子的全长</td></tr><tr><td>50 cm × 40 cm × 20 cm 笼子（大鼠笼）</td><td>Alternative Design Manufacturing</td><td>RC88D-PC</td><td></td></tr><tr><td>饮水瓶</td><td>Alternative Design Manufacturing</td><td>WB16FS</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢丝</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SWX-4029</td><td>用于支撑饮水瓶的U形金属丝</td></tr></tbody></table>

一种替代传统nasa小鼠后肢去负荷模型的新方法

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Morey-Holton后肢去负荷（HU）法是一种被广泛接受的美国国家航空航天局（NASA）地面模型，用于研究啮齿类动物的失用性萎缩4-6。本研究评估了一种替代标准Morey-Holton HU尾部牵引技术的小鼠实验方法。共54只雌性小鼠（4–8月龄）接受后肢去负荷处理，其中34只持续14天（n=34），20只持续28天（n=20）。另取22只小鼠在去负荷后恢复3天正常笼内活动，以评估其恢复情况（n=22）。另设76只年龄匹配的小鼠作为负重对照组。
在进行HU之前，使用一根2-0无菌外科钢丝穿过尾部形成尾环th, 6th，或 7th 椎间盘间隙并塑造成环状，用于悬挂小鼠。尾环的椎体位置应选择得当，以平衡动物体重，同时不影响排便。
我们通过评估小鼠在悬吊前后的体重、比目鱼肌萎缩程度以及悬吊后肾上腺质量，来判断这种新型悬吊（HU）技术的成功程度。小鼠在悬吊前的体重为 24.3 ± 2.9 g，在经过 14 天悬吊后（22.7 ± 1.9 g）、28 天悬吊后（21.3 ± 2.1 g）或 3 天恢复期后（24.0 ± 1.8 g），体重均未出现显著下降。比目鱼肌质量在悬吊 14 天和 28 天后分别显著降低（-39.1% 和 -46.6%）（p&lt;0.001）。经过 3 天恢复期后，比目鱼肌质量显著回升至对照组的 74%。悬吊组小鼠的肾上腺重量与对照组相比无显著差异。
我们新型尾部悬吊（HU）方法的成功体现在动物体重的维持、肾上腺重量与预期文献值相当，以及悬吊后比目鱼肌出现萎缩，均符合已有报道的文献数值2, 7, 8。该 HU 方法的主要优势包括：1）在悬吊过程中便于对尾部进行检查；2）显著降低尾部缠绕及悬吊过程中常出现的发绀、炎症和/或坏死尾部的发生概率；3）小鼠无法啃咬牵引胶带，避免其脱离悬吊装置；4）悬吊结束后迅速恢复，且立即恢复正常笼内活动。

我们建立了一种小鼠交替性后肢去负荷模型。与传统的Morey-Holton尾部牵引技术相比，我们采用的后肢去负荷尾环法主要优势在于操作简便直接，可最大程度减少对动物的应激反应。

一种替代传统NASA小鼠后肢去负荷模型的新方法

Morey-Holton后肢去负荷（HU）法是一种被广泛接受的美国国家航空航天局（NASA）地面模拟模型，用于研究……

本实验的总体目标是采用一种更简单、更直接的方法对小鼠进行后肢去负荷（hind limb unloading，简称 hu），以最大程度减少动物所受的应激。该尾部固定方法可有效诱导后肢萎缩，同时不损害小鼠的整体健康和体重。第一步是在成年小鼠尾部植入一个尾环。在整个研究过程中，必须记录动物的体重和健康状况。然后组装后肢卸载装置，并将其放入将要进行卸载操作的笼子中。待动物恢复后，将其放入装置中以进行卸载程序。最终，通过测量身体和肌肉质量，可获得结果，这些结果显示出悬吊小鼠后肢出现肌肉萎缩。与现有的方法（如Maori Holton胶带固定法）相比，该技术的主要优势在于小鼠尾部皮肤始终可见。小鼠无法从悬吊装置中逃脱或摆弄圆环，且恢复更快，能维持稳定的体重。该方法有助于解答肌肉骨骼生理学领域以及重力与空间生物学中的关键问题，例如如何预防长期身体不活动、卧床休息、肢体固定、微重力环境、神经肌肉疾病以及随着年龄增长所导致的骨骼肌萎缩和骨质流失。当我们首次在使用Maury Holden尾部固定技术时遇到操作困难，便萌生了这一想法。在演示该技术的过程中，由于小鼠从后肢固定装置中逃脱，我们持续损失实验动物和实验数据。今天参与实验的是来自我实验室的高级研究助理安德烈·费拉拉（Andre Ferrara）。协助安德烈工作的还有实验室的博士生杰奎琳·克里斯西（Jacqueline Chrissy）以及同在实验室的本科生安德鲁·邓恩（Andrew Dunn）。首先对手术区域进行消毒，用异氟烷麻醉一只成年小鼠，然后记录小鼠体重，并将其置于加热垫上。用氯己定溶液擦拭尾部，为手术做好准备。从尾部末端的体毛开始计数，找到尾部两个骨性隆起之间的第五、第六或第七椎间隙。使用止血钳和20号5G针头，在两个椎骨之间穿刺进入椎间隙，制备一个引导孔。拔出针头后，插入一根钢丝缝线。通过孔洞切割至10厘米长度。缝线应从尾部两侧各伸出5厘米。将拇指尖放在尾部，用另一只手将钢制缝线缠绕在拇指上。将末端拧转形成一个大环。缠绕或环状部分的长度应为正负三毫米。用止血钳夹住缝线的一股，弯成一个较小的环，使其末端尽可能贴近原始大环上的拧转处。剪去多余的导线，并将绞合的导线向后弯折。使用硝酸银棒止住任何额外出血。术后让动物恢复5至7天，再进行后肢悬吊（hind limb unloading）或hu处理。将每个吝啬屋单独放置，以防止尾环相互缠绕。在笼子顶部铺设一层一英寸宽、由八分之三英寸厚的带孔镀层钢条制成的网，并用胶带固定。再添加一个垫圈和一个翼形螺母，但不要完全拧紧，以便后续进行调整。将机用螺钉穿过线轴的中心孔，以防止线轴脱落。在线轴螺钉的末端拧上一个尼龙锁紧螺母。线轴应能自由旋转。将鱼线转环的扣环插入 bobin 的下部。使用钳子将一个回形针弯成 S 形钩状。将 S 形钩的一端穿过鱼线转环的孔洞，并用钳子将其夹紧闭合。将U形金属丝平行于笼内螺钉放置，并将两端弯向侧面。为支撑整瓶水，将水瓶插入U形金属丝中，使出水口朝下但不接触底部。使用胶带将水瓶固定在笼子上。将一个两英寸的文件夹夹子掰开，保持足够的张力，使其能够在后肢减负操作前夹住几块食物而不压碎颗粒饲料。记录小鼠的体重，用于后续比较。随后，将S形钩的开口端穿过尾部突出的较小金属环。通过拧紧或松开机器上的下部翼形螺母来调节小鼠的高度。小鼠的下肢不应承重。达到最佳高度后，拧紧上部翼形螺母，并将水瓶重新定位至一根新形状的金属丝上，确保小鼠无法用后肢攀爬到出水口。为测量研究期间的食物消耗量，将饲料颗粒在放入文件夹夹子前进行称重。每只小鼠提供约8至10克饲料，以满足其每天约5至6克的摄食量。每个小鼠笼位，将带有饲料的文件夹夹子置于笼底，防止小鼠攀爬其上，并使用 duct tape 将其固定。使用两英寸乘两英寸的羽毛束，松散缠绕。将尾羽缠绕在旋转环上。取一小束尾羽缠绕在羽毛束上，将羽毛束固定于尾部。此步骤至关重要，可防止尾巴下垂，导致血液积聚于尾尖并引发尾部坏死。在笼子的另一侧，对另一只动物重复相同的操作。每笼饲养两只动物时，应将它们放置在彼此几乎可以接触的位置。将动物放置在笼子中央。向笼内加入少量玉米芯垫料，确保垫料不足以让小鼠堆积成堆。在后肢去负荷操作结束后，将动物从装置中取出，并取下尾部固定环。使用剪线钳记录体重，并将动物放回其饲养笼中恢复。经过一段恢复期后，再次等待动物稳定，然后测量比目鱼肌和肾上腺质量。尾部切除手术前的体重与手术后五天及人源化处理前的体重相比无显著差异。尽管后肢悬吊14天和28天导致小鼠体重出现轻微但无统计学意义的下降，但小鼠在恢复3天后体重已完全恢复至悬吊前水平。此处显示了自主活动对照组小鼠和后肢悬吊小鼠的食物摄入量。在28天内，悬吊小鼠的平均每日食物摄入量与对照组相比无显著差异。悬吊14天和28天后均观察到明显的比目鱼肌萎缩，表明该模型在恢复3天后仍具有有效性。术后组比目鱼肌质量显著高于两个悬吊组，但仍显著低于自由活动的对照组动物。切除双侧左、右肾上腺并称重，以作为动物应激状态的指标。如图所示，对照组小鼠与 HU 小鼠的平均肾上腺重量相近。掌握该定制手术后，每只小鼠的操作可在 5 至 10 分钟内完成，手术后的笼具设置可在 15 分钟内完成。在完成该操作后，还可采用其他方法，如小鼠、Hein、肢体重新负荷以及废用性萎缩后的恢复实验，以回答更多科学问题，例如肌肉与骨骼系统在经历长期废用后如何恢复并对此类状态作出响应。现在您已经观看了本视频，应该对如何在小鼠中实施后肢去负荷有了充分的理解。该技术可用于研究多种组织和系统，例如在负荷与重新负荷条件下的心血管、肌肉骨骼和内脏系统，并可结合多种小鼠模型（如基因敲除或基因敲入模型）进行应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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