Name: Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyolarında gen ekspresyonu desenlerini gözlemlemek için tüm dağı in situ hibridizasyon (WISH) yöntemini. Bu teknik, moleküler biyoloji ve organizmal biyoloji arasında köprü kurarak gelişimsel biyoloji eğitimini güçlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders yönetim rolleri için, Syracuse Üniversitesi, Dr. Marilyn Kerr Biyoloji Bölümü kabul etmek istiyorum. Albertson laboratuar Sağlık / National Institute of National Institutes Yaşlanma Ulusal Sağlık / Ulusal Enstitüsü Diş ve Kraniofasial Araştırma Enstitüleri, gibi hibe R01AG031922 hibe R21DE019223 tarafından desteklenmektedir.

1. Plazmid cDNA Hedef Dönüşüm Bölüm I: Plazmid Dönüşüm (Gerekli Zaman: 3 saat artı bir gecede inkübasyon) <ol><li> 42 ° C su banyosunda sıcak SOC besin suyu (reaksiyon başına 500 mcL) </li><li> Buz üzerinde yetkili hücreleri Çözülme </li><li> 25 mcL yetkili hücrelere plazmid 1 mcL ekle </li><li> 20 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. </li><li> 45 saniye için 42 ° C su banyosu içinde ısı şok hücreleri </li><li> Hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde hücre </li><li> 42 ° C besin suyu hücrelerin her flakon 500 mcL ekleyin </li><li> 37 ° C'de 2 saat boyunca dakikada 255 rotasyonlar (rpm) çalkalayınız </li><li> Plaka 75 Luria Bertani (LB) agar plaklarına mcL dönüşüm karışımı </li><li> Inkübe plakaları 37 ters ° C gecede </li></ol> Bölüm II: E. coli Kültür (Zaman: 15 dakika artı bir gecede inkübasyon) <ol><li> Bir kültür tüp içine her reaksiyon, kısım 3 ml LB suyu ve 50 mg / ml ampisilin 3 mcL </li><li> Agar plaka 1 bakteri kolonisi kazıyın ve her kültür tüpüne ekleyin </li><li> 37 kültür tüpleri çalkalayın ° C 255 rpm gecede </li></ol> Bölüm III: Plazmid Hazırlık (Gerekli Zaman: 1.5 saat) <ol><li> 5 Başbakan FastPlasmid Mini Kit (Katalog # 2300000) kullanarak bir gecede kültürlerden gelen plazmid Isolate </li><li> Hazırlanan plazmid varlığını kontrol etmek için, etidyum bromür ile boyanmış% 1 Tris-asetat-EDTA (TAE) ve jel kiti yıkandı, DNA çalıştırın </li></ol> 2 Situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi Bölüm I: Plazmid lineerleştirilmesi (Gerekli Zaman: 2,5 saat) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> Plazmid Hazırlayan: </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Restriksiyon enzimi * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Tampon ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10X Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Dietil Pyrocarbonate (DEPC) Su </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe * Plazmid ile değişir ** Restriksiyon enzimi ile değişir. </li></ol> Bölüm II: Transkripsiyon (Gerekli Zaman: 3 saat) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> Plazmid Doğrusal </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 10X Transkripsiyon Tampon ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenin Etiket Karışımı </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polimeraz * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC Su </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> 1 saat için 37 ° C'de inkübe </li><li> Polimeraz * 2 mcL ekle </li><li> 1 saat için 37 ° C'de inkübe </li><li> Ekle 2 DNaz mcL </li><li> 37 ° C'de 20 dakika * Plazmid ile değişir ** Polimeraz ile değişir. </li></ol> Bölüm III: Yağış (Gerekli Zaman: gecede inkübasyon, 1 saat 5 dakika artı 2 saat santrifüj ve yeniden askıya alma) <ol><li> 0,2 M EDTA 4 mcL ekle </li><li> 4M lityum klorür 5 mcL ekle </li><li> Buz gibi% 100 etanol 150 mcL ekle </li><li> Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe </li><li> 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj </li><li> 7 dakika Kuru pelet </li><li> 20 mcL DEPC su yeniden askıya </li><li> 37 ° C'de 5 dakika </li></ol> Bölüm IV: Fraksiyonu - prob boyutu 0,6 kb daha büyük ise gerçekleştirin (Gerekli Zaman: Genellikle hayır, 20 dakikadan fazla prob boyutuna göre değişir) <ol><li> 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. <table border="1"><tbody><tr><td> RNA Probe </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC Su </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Çamaşır sodası </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> 60 ° C su banyosunda inkübe edin. Denklemi inkübasyon süresi Duy: Süresi (dak.) = (kb başlangıç ​​istenilen kb) / (0,11 x kb x itibaren istenilen kb) Ortalama istenen büyüklük = 0.6 kb </li></ol> Bölüm V: Final Yağış (Gerekli Zaman: 5 dak.gecede inkübasyon, 1 saat oda ısısında artı 2 saat) santrifüj ve jel elektroforezi için yeniden askıya alma, 1 saat <ol><li> 40 mcL DEPC su ekleyin </li><li> 8 mcL Sodyum Asetat ekle </li><li> 1.04 mcL Asetik Asit </li><li> 240 mcL buz gibi% 100 etanol ekle </li><li> Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe </li><li> 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj </li><li> 7 dakika Kuru pelet </li><li> 20 mcL DEPC su yeniden askıya </li><li> Karıştırmak için Vortex </li><li> Spastine Özgü Riboprop varlığını kontrol için% 1 TAE jel boyanmış, etidyum bromür ile tekrar askıya çözüm çalıştırmak </li></ol> 3. Tüm Dağı Situ Hibridizasyon Bölüm I: Embriyolar fiksasyonu ve Proteinaz K Sindirim (Gerekli Zaman: Fix gecede artı 4 saat saklama için ertesi gün, 2,5 saat depolama Bölüm II) <ol><li> Zebra balığı embriyolar sahnelenen toplayın ve gece 4,% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltmek ° C </li><li> Tween-20 (PBSt) 3 kez 10 dakika her biri için% 0.1 içeren sabit embriyolar yıkayın fosfat tamponlu salin </li><li> Ince uçlu forseps kullanarak deneysel reaktifler, elle dechorionate embriyolar (gerekirse) embriyoların pozlama sağlamak için </li><li> Bir saat süreyle% 25 oranında kademeli bir dizi her yıkama, yıkama ve PBSt% 50 metanol dehydrate embriyolar, daha sonra -20 ° C'de% 100 metanol içinde saklamak </li><li> Kullanıma hazır,% 50 (2 kez) ve% 25 (1 kez), her biri için 10 dakika PBSt metanol yıkama PBSt embriyoların rehidrate. Son olarak, her biri için 10 dakika% 100 PBSt 2 kez yıkayın. Kesin zamanlama PBSt / metanol yıkar için önemli değildir </li><li> Koyu pigmentleri uzaklaştırmak için PBSt% 10 hidrojen peroksit çözeltisi gerekirse, Bleach embriyolar. Embriyolar, 10-20 dakika boyunca, embriyonun yaşına bağlı olarak hidrojen peroksit çözeltisi inkübe gerektiğini ve mikrofuge'de tüp kapağı hava basıncı birikmesini önlemek için açık kalmalıdır </li><li> 50 mg / ml proteinaz K ile Digest embriyolar embriyo yaşına bağlı olarak 3-15 dakika PBSt 1:5000 sulandırılmış </li><li> Re-fix 30 dakika boyunca% 4 PFA embriyolar ve her 5 dakika için, PBSt 3 kere yıkayın </li></ol> Bölüm II: Riboprobes Hibritleşme (Gerekli Zaman: 3 saat artı hibridizasyon için bir gecede, 1.5 saat Bölüm III ertesi gün) <ol start="9"><li> 2-3 saat önceden ısıtılmış 70 ° C su banyosunda prehybridization solüsyonu (PHS) embriyo Prehybridize </li><li> PHS Kaldır 0.5 ml, 70 ° C gece boyunca inkübe hibridizasyon çözüm ve 1.5 mcL önceden sentezlenmiş digoxigenin etiketli riboprobes, ekleyin. Sıcaklık Spastine Özgü Riboprop hedef bağlı olarak birkaç derece içinde dalgalanma </li><li> Ertesi gün, 70 embriyolar yıkayın ° C PHS her biri için 10 dakika tuzlu 2X-sodyum sitrat (SSC)% 75,% 50 ve% 25 oranında kademeli çözümler, sonra 68, 30 dakika boyunca 0,2 X SSC yıkayın ° C </li><li> Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında Maleik Asit Buffer (MAB) 2 kez yıkayın </li></ol> Bölüm III: Anti-digoxigenin (α-DIG) Antikor Kuluçka (Gerekli Zaman: 3 saat artı engellemek için bir gecede 2,5 saat Bölüm IV ertesi gün) <ol start="13"><li> 12 plaka embriyolar transfer </li><li> Ön blok embriyolar en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında 1-2 ml engelleme çözümü </li><li> Aynı zamanda, bu çözüm engelleme çözümünün ikinci bir birim hazırlıyor ve anti-digoxigenin antikor 1:2000 seyreltilmesi antikor ön blok </li><li> Blok öncesi çıkarın ve 1-2 ml önceden bloke α-DIG çözüm ekleyin, 4 gece boyunca inkübe ° C </li><li> Ertesi gün, MAB embriyoların yıkayın. Embriyolarının ilk 5 dakika MAB inkübe izin ver, sonra tampon değişiklikleri gerçekleştirmek ve iki 10 dakika, bir 30 dakikalık ve bir 60 dakikalık zaman aralığı inkübe edin. Kesin zamanlama gerekli değildir </li><li> Alkalen Fosfataz (AP) tampon her 5 dakika için embriyoların 3 kere yıkayın </li></ol> Bölüm IV: Boyama ve Final İşleme (Gerekli Zaman: 1 saat, geceleme boyama kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak, gliserol yıkar, gliserol yıkama başına 6-10 saat başına 4 saat gliserol saklanabilir) <ol start="19"><li> Boyama yeterli kadar, 1-2 ml boyama çözüm embriyoların plaka folyo ile sarın ve düzenli aralıklarla (her 20 dakika) boyama kontrol </li><li> Boyanma reaksiyonu durdurmak için her biri için 5 dakika PBSt 2 kez embriyo yıkayın </li><li> Arka plan boyama kaldırmak için,% 100 metanol sonra 10 dakika yıkar% 25 (1 kez) ve% 50 (2 kez) PBSt metanol kullanarak embriyolar dehydrate </li><li> Embriyoların% 100 metanol içinde en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe izin verin </li><li> 50% 10 dakikalık yıkama (2 kez) ve% 25 (1 kez) PBSt metanol kullanarak PBSt rehidrate, sonra% 100 PBSt 2 kez yıkayın </li><li> Lekeli e aktarma4 kademeli bir yıkama, bir dizi ve mağaza kullanarak PBSt% 80 gliserol çözüm mbryos ° C. </li></ol> Tarifler: <ul><li> LB agar plakları 10 g LB agar + 250 mL distile su, otoklav, dokunmatik serin her petri kaplarına dökün 15-20 mL sıcak çözüm, 250 mcL ampisilin, agar katılaşmaya izin </li><li> LB besiyeri 12,5 g LB Broth + 200 mL distile su, otoklav, kullanmadan önce soğumasını bekleyin. </li><li> % 1 TAE jel 0.4 g agaroz, 40 ml 1X TAE, 2 mcL etidyum bromür; yük 7 mcL plazmid (cDNA Hedef Plazmid Dönüşüm) veya 3 mcL Spastine Özgü Riboprop ve 4 mcL DEPC su (in situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi) + 1 mcL yükleme boya, 5 mcL DNA merdiveni </li><li> Prehybridization çözüm% 50 formamid, 5X SSC, 9.2mM sitrik asit,% 1 Tween-20 </li><li> Hibridizasyon çözüm prehybridization çözümü artı 500 mg / ml tRNA ve 50 mikrogram / ml Heparin </li><li> Maleik Asit MAB-100mm, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH,% 0.1 Tween-20, 7.5 pH </li><li> MAB Engelleme Çözüm-3 parça MAB, 1 kısım% 10 Boehringer engelleme reaktif, 1 parçası ısı kuzu serum devre dışı </li><li> 9.5 AP tampon-60mm Tris-HCl pH, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2,% 0.1 Tween-20 </li><li> Boyama Çözüm-5-Bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP) ve Nitro mavi tetrazolium (NBT) AP tampon </li></ul> 4. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR Doğru yapıldığında, NBT BCIP ve alkalen fosfataz arasındaki reaksiyon zebrafish embriyo mor bir leke olarak görünmelidir mor bir çökelti oluşacaktır. Riboprobes ilgi gen cDNA ilgili daha önce sentezlenmiş olmalıdır. Bu nedenle, herhangi bir leke görüntülenebilmekte, o belirli gelişimsel aşamada ilgi gen transkripsiyonu edildiği zebrafish alanlarda temsil söylenebilir. Fgf8a (Reifers vd, 1998; Şekil 2); deltaC (Oates ve ark, 2005) Bu dersin amacı, riboprobes aldh1a2 (Begemann ve ark, 2001; Şekil 1, daha önce raldh2) sentezlenmiştir; myod1 (Weinberg ve ark, 1996); shha (. Krauss ve ark, 1993), pax2a (Marka ve ark, 1996; Şekil 3) ve myl7 cDNA (önceden cmlc2; Yelon ve ark, 1999). Boyama, orta hatta ve Somitlerin tailbud, myotome, beyin ve kalp gibi anatomik yapıların bekleniyordu. Ace/fgf8a mutantlar bu yapıların pek çok kusurları olması beklenmektedir . Boyama kolayca standart bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak görüntülendi. (Schoenwolf, 2009; D'Costa ve ark, 2009; Schmoldt ve ark, 2009. Clark, 2003) Ek kaynaklar burada açıklanan benzer teknikleri İSTEDİKLERİ hakkında daha fazla bilgi ve sorun giderme içerir. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 aldh1a2 için özel riboprobes ile melezleşmiştir olmuştur zebrafish embriyo 24 saat gübreleme,. Özel boyama, göz, beyin, göğüs yüzgeci tomurcuk primordia ve Somitlerin görülebilir. Anterior, üst, arka alt etmektir. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 13 hücre gruplarının gelişme aşamasında zebrafish embriyo fgf8a için bir prob özel melezleşmiştir olmuştur. Özel boyama telencephalon, sırt diensefalon, orta beyin-Beyin sınır, Somitlerin ve tailbud görülür. Ventral sol, sağ dorsal. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 pax2a, sinir sisteminin görüntülenmesi için yararlı güçlü bir belirteç için bir Spastine Özgü Riboprop özel melezleşmiştir 22 saat sonra döllenme zebrafish embriyo. Özel boyama koroid fissür, orta beyin Beyin sınır, otik vezikül ve spinal kord nöronları görülebilir. Dorsal anterior sol görünümü.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
<li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7%2C+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li>
<li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li>
<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
<li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+M+%22In+situ+Hybridization%3A+Laboratory+Companion%22">In situ Hybridization: Laboratory Companion</a>. , Wiley-VCH. (2003).</li>
<li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+genetics%3A+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Volume+1%22">Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).</li>
<li>Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+limb+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+somite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.</li>
<li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li>
<li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li>
<li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+%28ace%29+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li>
<li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchoenwolf%2C+GC+%22Laboratory+Studies+of+Vertebrate+and+Invertebrate+Embryos%3A+Guide+and+Atlas+of+Descriptive+and+Experimental+Development%22">Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development</a>. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type%2C+no+tail+and+spadetail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li>
</ol>

DİLEĞİYLE Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar ders öğrenciler bilinen gen ekspresyonu görselleştirme yoluyla anatomik gelişimi genetik rollerini anlamalarına yardımcı olmak için kullanılmıştır. Dersin ilk bölümü için, öğrenciler, onlara yeterli zaman, çalışma anlamak, karşılaştırın ve kontrast omurgalı anatomi izin, birkaç farklı kordalı takson temsil organizmalar üzerinde diseksiyonu. Dersin ikinci bölümü için bir giriş olarak, öğrenciler zebrafish geliştirme ve anatomi açıklayan resmi bir ders verildi. DİLERİZ deney yöntemleri ve beklenen sonuçları da ele alındı. Öğrenciler daha sonra canlı zebrafish somitogenesis ve gelişim prim-6 aşamaları verildi, 2 ve 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) diseksiyon mikroskop altında incelemek için. Bu öğrenciler zebrafish embriyolar neye benzediğini daha iyi bir anlayış ve ontogeny üzerinde meydana gelen morfolojik değişiklikler türleri vermek oldu. , Bir sonraki laboratuvar oturumda, öğrenciler DİLERİZ daha önce yapılmış olan zebrafish embriyolar verildi. Onlar her gen ilgi (Spastine Özgü Riboprop kullanılan) için gen ekspresyonu incelemek ve açıklamak için istendi. DİLERİZ için kullanılan Embriyolar heterozigot ace/fgf8a hattı üyeleri arasında çiftleşmelerin elde edilmiştir. Mendel kalıtım dayanarak, ace/fgf8a çiftleşmelerin embriyoların% 25 homozigot mutantlar olmak ve bu derste odaklanmış anatomik yapıların birçok kusurlarını sergilemek bekleniyordu. Albertson laboratuarında yayınlanan raporlar ve yayınlanmamış gözlemler göre, beyin ve uygunsuz kalp döngü kusurları Somitlerin hatalarına (Albertson ve Yelick, 2005, kişisel gözlemler Marka ve ark, 1996) yanı sıra, beklenen edildi. Öğrenciler sunulan her gen ekspresyonu desen için, tüm örnekler, yabani türü (geliştirmenin erken aşamalarında heterozigot hayvanlar vahşi tip kardeşleri ayırt edilemez) ve homozigot mutantlar incelemek istendi. Daha sonra kendi sonuçlarını açıklayan laboratuvar raporları yazmak istedi, ve anatomi ve genetik, hatalı gen ekspresyonu anatomik malformasyonlar nasıl tetiklemiş olabileceğini bilgiye göre. Öğrenciler, bu heyecan ve merak ile laboratuar egzersiz almak için görünüyordu. En önce İSTEDİKLERİ hiç kullanılmamış olduğunu ve dersin bu bölümünde son derece ilgilenmişlerdir. Öğrenciler ilginç zebrafish embriyolar gen ifadesinin farklı desen bulundu, hatta bazıları açıklanan boyanma böyle bir gülen yüz olarak bilinen desen ve semboller ile ilişkilendirilmesi tarafından görüntülendi. Sonuçlanan laboratuvar raporları, öğrencilerin DİLERİZ protokol ve belirli anatomik yapıları genlerin ifadesi genel bir anlayış vardı gösterdi. Huelsken ve ark, 2002; Geetha-Loganathan ve ark, 2008a;. Geetha-Loganathan ve ark, 2008b Öğrenciler ayrıca belirli genlerin fonksiyonlarını anlamak için gerekli laboratuar sırasında (Stickney ve ark, 2000 İSTEDİKLERİ kullanılarak çalışıldı .) Bazı öğrenciler sınırlı arka plan sinyalizasyon yollarının bilgi ve ilgi gen olduğunu, ancak açıkça görülmüştür. Bu kavramlar hakkında daha fazla bilgi giriş dersi gelecek Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi içerisinde DİLERİZ kullanımı hoş bir ilave olabilir WISH. Protokol genellikle ders çizelgesi bağlı olarak, arka arkaya dört gün sürer, öğrenciler sadece sınıf ve öğretim geri kalanı için sorumlu olmalıdır deneyinin bir parçası tamamlamak için mümkün olabilir. Öğretim Görevlisi tüm Yukarıdaki adımları gerçekleştirdikten Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji sınıfta, öğrenciler, laboratuvarında boyama reaksiyonları tamamladı. Gerçekleştirmek sınıf İSTEDİKLERİ öğrencilerin tercih edilirse, protokol sınıfın zaman çerçevesine bağlı olarak, çeşitli laboratuvar oturumda yapılabilir alt birimden ayrılabilir. Burada haftada yalnızca bir kez laboratuvar toplantı nedeniyle olduğu gibi öğrenciler, tüm protokol gerçekleştirmek için bu mümkün değilse, öğrenciler, kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak sınıf başında boyama çözüm ve boyama tamamlandı bir saat içinde. Leke geliştirmek için gereken süreyi her Spastine Özgü Riboprop ve çeşitli deneysel koşullar büyük ölçüde değişir ve sınıfın önünde önceden belirlenmiş olmalıdır. Özellikle, öğrenciler sadece laboratuarda leke gelişmekte olması durumunda, öğretim, sınıf dışında önemli bir zaman ve çaba gerektiren tüm Yukarıdaki adımları sorumlu olacaktır. İstenirse, kısa bir alternatif DİLERİZ için ancak şu anda gelişim genleri için zebrafish-spesifik antikorların hazır olmayan protein yerelleştirme görselleştirmek için antikor etiketleri kullanarak, immünhistokimya olabilir. Başka bir seçenek de farklı omurgalı hayvan türü DİLERİZ gerçekleştirmek için birnd öğrencilerin farklı organizmalar aynı genlerin ekspresyonu karşılaştırmak (. Aramaki ve ark, 2007; Gelişen Model Organizmalar, 2008; Pizard ve ark, 2004 Gelişmekte olan Model Organizmalar, 2010) . Kullanarak herkesin ortak hedefi Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders moleküler biyoloji teknikleri anatomik gelişimini incelemek için nasıl kullanıldığını öğrencilere göstermek için WISH. Ayrıca gen ekspresyonu sadece gelişimsel malformasyonlar değil, aynı zamanda evrimsel bir değişime yol açabilir nasıl değişmiş olarak spekülasyon yapmak öğrenciler için bir fırsat sağladı. Evrimsel gelişim biyolojisi (genellikle &quot;evo-devo&quot; olarak anılacaktır) olarak tanımlandı, hızla büyüyen bu alanda çalışma geliştirilmesi yoluyla bağlantı genotip ve fenotip ve evrimsel değişimin potansiyel mekanistik üsleri aydınlatmak için amaçlamaktadır. Bu alanın yükselişi ile birlikte, daha ekolojistler, organizma biyolog, ve fizyoloji araştırma moleküler teknikler kullanıyorlar. Biz Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders DİLERİZ kullanımı, güncel teknolojik araştırma ve kavramsal gelişmeler ile güncel ve üst düzey biyoloji derslerinin biyolojik altbaşlıklarla birleştirerek daha iyi bir yatay hizalamayı kolaylaştırmak için müfredat yetişmek için yardımcı olacağını ileri sürmektedir. Ayrıca, bu bütünleştirici bir yaklaşım daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki giden öğrencilerin bir dersten bir çeşit biyolojik araştırma teknikleri öğrenme fırsatı sağlayacaktır.

<ul><li> Otoklav </li><li> Mikro-santrifüj </li><li> 37 ° C inkübatör (çırpıcı ile) </li><li> 4 ° C mikro santrifüj </li><li> Su banyosu </li><li> Girdap </li><li> Jel elektroforezi cihazları </li><li> -20 ° C derin dondurucu </li><li> -80 ° C derin dondurucu </li><li> Rocker / çalkalayıcı </li><li> 4 ° C buzdolabı </li><li> Diseksiyon mikroskobu (tercihen öğretim ekran veya kamera ile) </li></ul>

tüm dağı in situ moleküler biyoloji ve organizma biyoloji link hibridizasyon

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

In situ hibridizasyon Tüm montaj (DİLERİZ) moleküler biyoloji laboratuvarlarında bütün montaj numune içinde spesifik mRNA transkript yerelleştirme yoluyla gen ekspresyonu çalışma için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu tekniği (Albertson ve Yelick, 2005 adapte), bir üst düzey lisans Syracuse Üniversitesi&#39;nde Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuar sınıf kullanıldı. Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi lab dersinde ilk üçte ikisi, öğrencilerin öncelikle geleneksel diseksiyonlar ve modellerin kullanımı ile çeşitli kordalı takson temsil eden çeşitli organizmaların embriyoloji ve brüt anatomi çalışma fırsatı verdi. Dersin son bölümünü DİLERİZ zebrafish embriyolar yapıldı moleküler teknikler kullanılarak omurgalı gelişme gözlem yoluyla anatomi öğretim yenilikçi bir yaklaşım söz konusu. Heterozigot fibroblast büyüme faktörü 8 (fgf8a) mutant hattı, as, kullanılmıştır. Mendel kalıtım nedeniyle, ace üretilen vahşi tip, heterozigot ve homozigot ace/fgf8a mutantlar 01:02:01 oranı intercrosses. Orta hatta ve kalp, Somitlerin, tailbud, myotome, ve beyin gibi anatomik yapıların geliştirilmesi bilinen ekspresyonu RNA probları kullanılır. DİLEĞİYLE öğrencilerin sınıfta boyanma reaksiyonu gerçekleştirirken, 13 hücre gruplarının ve prim-6 kademeli zebrafish kullanılarak yapıldı. Gelişmenin farklı aşamalarında zebrafish embriyoların çalışmada, öğrencilerin bu anatomik yapıların ontogeny içinde nasıl değiştiğini gözlemlemek için yeteneği verdi. Buna ek olarak, bazı ace/fgf8a mutantlar uygunsuz kalp döngü ve hücre gruplarının ve beyin gelişimi hatalarına görüntülenir. Bu laboratuvarda, öğrencilerin yanı sıra, gen ekspresyonu hem de dış anatomi kullanarak çeşitli organ sistemlerinin normal gelişimini gözlemledi. Onlar da yanlış anatomik gelişimi ve gen ekspresyonu (yani varsayılan mutantlar) gösteren embriyolar tespit ve tanımlanmıştır. Zaten gerekli donanımları kendi kurumlarında veya laboratuvar ve müfredat inovasyon için fon sınırlı eğitmenler için reaktifler ve cihazları finansal maliyet, zaman ve çaba parçası gerekli, dikkate alınması gereken bir faktör olabilir ayarı ne olursa olsun eğitmen. Bununla birlikte, sınıf laboratuar ortamında bu tip DİLERİZ kullanımı gelişim genetiği ve anatomi arasında önemli bir bağlantı sağlayabilir iddia. Teknoloji gelişmeler ve moleküler düzeyde organizma geliştirme çalışma yeteneği daha kolay, ucuz ve giderek daha popüler hale geldikçe, birçok evrimsel biyolog, ekolojistler, fizyoloji, moleküler biyoloji alanında araştırma stratejileri yönelmektedir. Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar sınıfta İSTEDİKLERİ kullanarak moleküller ve anatomisi tek bir ders içinde yakınsama nasıl bir örnektir. Bu üst düzey üniversite öğrencileri daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki önde gelen modern biyolojik araştırma teknikleri, pratik yapma imkanı verir.

Tüm montaj<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (DİLERİZ) diseksiyonları omurgalı ek olarak bir üst düzey lisans Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji dersinin kullanılmıştır. Bu öğrencilerin yanı sıra brüt anatomi gibi bir ders çalışma içinde organizma ve moleküler biyoloji bağlayan gen ekspresyonu çalışma fırsatı verdi.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Tüm mount in situ hibridizasyon (WISH), moleküler biyoloji laboratuvarlarında ... lokalizasyonu aracılığıyla gen ekspresyonunu incelemek için kullanılan yaygın bir tekniktir.

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı embriyolarında gelişimin belirli aşamalarındaki gen ekspresyon modellerini gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen mRNA'ya digoksin etiketli antisens riboprobun hibridizasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım ise riboprobun tespit edilmesidir.Antikor için doxygen kullanıldığında, antikordaki enzim alkali fosfataz ile konjugasyon yapılmıştır. Prosedürün üçüncü adımı, alkali fosfataz enzimi ile reaksiyona girerek çözünmeyen mor bir çökelek oluşturan NBT ve BCIP eklenmesiyle gerçekleştirilen boyamadır. Prosedürün son adımı, spesifik olmayan boyamayı azaltmak için yeterince boyanmış embriyoların metanol içinde inkübe edilmesidir.Nihayetinde, tüm zebra balığı embriyolarında gelişimin belirli aşamalarındaki gen ekspresyon kalıplarını gösteren sonuçlar, tümle mount (whole mount) in situ hibridizasyon kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin, geleneksel histoloji ders demoları veya diseksiyonlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, öğrencilere moleküler biyoloji ile organizma gelişimi ve evrimindeki eğilimler arasında kavramsal köprüler kurma fırsatı sunarak gerçekten bütünleştirici bir deneyim sağlamasıdır. Bu yöntemler geleneksel olarak birkaç model organizmanın gelişimini incelemek için kullanılmış olsa da, gelişimsel yolakların vertebra taksonları arasındaki korunmuşluğunu ve bu yolakların evrimsel yeniliklere yol açacak şekilde nerede saptığını anlamak amacıyla diğer model olmayan organizmalara da kolayca uygulanabilirler.Bu yöntem lisans öğrencileri için yabancı olabilir, bu nedenle bazı öğrenciler başlangıçta zorlanabilir ancak bu yöntemi öğrenmek, lisans araştırma deneyimlerinde ve üst düzey derslerde onlara fayda sağlayacaktır. Bu prosedüre başlamak için, bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 50 zebrafish embriyosunu bir mikro atık tüpüne aktarın. Fazla sıvıyı uzaklaştırın ve ardından tüpe 1.5 milliliters 4%para formaldehit pipetleyin.Embriyoların bulunduğu tüpü oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca bekletin. Ertesi sabah, tespit edici çözeltiyi çıkarın ve atın. Yıkama işlemi için embriyolara %0,1 tween 20 içeren 1,5 mililitre fosfat tamponlu salin çözeltisi ekleyin.Gerektiğinde, embriyoları manuel olarak kaplamak için ince uçlu pensler kullanın ve kaplanmış embriyoları temiz bir mikro füzyon tüpüne yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Ardından tüpe 1,5 milliliters %25 methanol ve PBST pipetleyin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, embriyoları rahatsız etmeden bu solüsyonun mümkün olduğunca fazlasını aspire edin.Ardından, PBST içindeki %50 metanol ile 1,5 mililitre değiştirin ve minimum bir saat inkübe edin. Son olarak, 1,5 mililitre %100 metanol ile değiştirin ve -20 °C'ye yerleştirin. Embriyolar -20 °C'de metanol içinde saklanabilir.Kullanıma hazır olduğunda, tüpteki metanolü pipetle çekip atın. Tübe PBST içinde %50 metanol ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Bu işlemi tekrarlayarak ikinci kez yıkayın, ardından solüsyonu aspire edin ve PBST içinde %25 metanol ile inkübasyonu tekrarlayın.Son olarak, %100 PBST ile 10'ar dakikadan iki kez yıkayın ve PBST içinde %10'luk hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayın. Zebra balığı embriyolarını, embriyonun yaşına bağlı olarak 10 ila 20 dakika boyunca oda sıcaklığında, mikro santrifüj tüpünün kapağı açık şekilde bu çözeltiye daldırın. Koyu pigmentasyonu gidermek için bir transfer pipeti kullanarak hidrojen peroksit çözeltisini çekip atın.Reaksiyonu durdurmak için embriyoları 1.5 mililitre PBST ile birkaç kez yıkayın. 50 miligram/mililitre'lik proteinaz K stok çözeltisini PBST içerisinde 1:5.000 oranında seyreltin. Genellikle 4.999 mililitre PBST içerisinde 1 mikrolitre proteinaz K kullanılır.Embriyolardaki PBST'yi uzaklaştırın. Bir transfer pipeti kullanarak mevcut sıvıyı boşaltın ve tüpe 1,5 milliliters proteinaz K çözeltisi ekleyin. Embriyoları, yaşlarına bağlı olarak oda sıcaklığında üç ila 15 dakika boyunca proteinaz K çözeltisi içinde bekletin.Reaksiyonu durdurmak için PBST ile birkaç kez yıkayın. Ardından PBST'yi uzaklaştırın ve embriyoları yeniden sabitlemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4'lük formaldehit içerisinde bekletin; paraformaldehidi bir transfer pipeti kullanarak uzaklaştırın ve atın. Embriyoların üzerine 1,5 mililitre PBST ekleyin ve beş dakika boyunca yıkayın.Viyoldaki PBST'yi dikkatlice pipetleyerek atın. Yıkama işlemini iki hacim daha PBST ile tekrarlayın. Ardından rip prob hibridizasyonuna geçin, su banyosunu 70 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun ve ön hibridizasyon çözeltisini hazırlayın.Ardından, PBST'yi uzaklaştırmak ve atmak için bir transfer pipeti kullanın. Embriyoları 0,5 milliliters ön hibridizasyon çözeltisine daldırın ve embriyoları rahatsız etmemeye dikkat ederek 70 degree Celsius su banyosunda iki ila üç saat inkübe edin.Mikro atık tüpündeki hibridizasyon öncesi çözeltiyi pipetle çekin ve atın. Tüpün içine nazikçe 0,5 milliliters hibridizasyon çözeltisi ekleyin. Ardından, daha önce sentezlenmiş olan doxygen'i etiketli ribo'ya hızlıca ekleyin.Tüplerde yaklaşık bir mikrogram/mililitre konsantrasyonunda ribo problar kullanılır. 70 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, iki kat tuzlu sodyum sitrat içinde %75, %50 ve %25'lik PHS çözeltilerinin yanı sıra 2X SSC ve 0,2X SSC çözeltilerini hazırlayın.70 °C'lik su banyosunda daha fazla çözelti ısıtın. Çözeltiler 70 °C'ye ulaştığında, bunları su banyosundan çıkarın. Ardından, tüpteki hibridizasyon çözeltisini aspire ederek atın.Her bir sıcak P-H-S-S-S-C çözeltisinden 0.5 milliliters ekleyin ve embriyoları her bir çözeltide 70 degrees Celsius sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin. Son olarak, embriyoları 0.2 times SSC çözeltisinde 68 degrees Celsius sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin. Tüpteki 0.2 times SSC çözeltisini aspire edin ve atın.Embriyoları, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.5 milliliters malik asit tamponu pH 7.5 içinde inkübe edin. Bu işlemi tekrarlayarak ikinci kez yıkama yapın. Yazılı protokole uygun olarak bloklama çözeltisini hazırlayın.MAB içindeki embriyoları 12 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa transfer edin. Fazla MAB'ı uzaklaştırın ve her birine bir ila iki mililitre bloklama solüsyonu pipetleyin.Oda sıcaklığında, ajitasyonla en az üç saat boyunca inkübe edin. Antijeni, kalan bloklama solüsyonu içerisinde 1/2000 oranında antikor ile seyreltin. Oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla en az üç saat boyunca inkübe edin.Embriyoları rahatsız etmemeye dikkat ederek, plaka kuyucuklarındaki bloklama solüsyonunu pipetle çekin ve atın. Daha önce hazırlanan anti-doxigen antikor ve bloklama solüsyonunu kuyucuklara nazikçe pipetleyin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, embriyoları beş kez 1.5 mililitre malik asit tamponu ile yıkayın. Embriyoların malik asit tamponunda beş dakika inkübe olmasına izin verin. Ardından, tampon değişimlerini gerçekleştirin ve iki kez 10 dakika boyunca inkübe edin.Bir adet 30 dakikalık ve bir adet 60 dakikalık aralık. Kuyucuklardaki son meic asit tamponu yıkamasını aspire edin ve pipeti atın. Kuyucuklara 1,5 ila iki mililitre alkalin fosfataz tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin.Bu işlemi iki kez tekrarlayın. Alkalen fosfataz tamponunu uzaklaştırın ve kuyucuklara 1,5 ila iki mililitre boyama çözeltisi ekleyin. Işıktan korumak için tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın ve 20 dakikalık aralıklarla hafifçe çalkalayın.Ajitasyonu durdurun ve yeterli boyanmanın gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek için embriyoları diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Yeterli boyanma gözlemlendiğinde, boyama solüsyonunu kuyucuklardan pipetle çekerek atın. Boyama reaksiyonunu durdurmak için PBST ile değiştirin.Yıkama işlemini başka bir hacim PBST ile tekrarlayın, kuyucuklardaki PBST'yi pipetle çekip atarak embriyolarıye kurutun. Kuyucuklara 1,5 ila iki mililitre PBST içinde %25 metanol ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. İşlemi, PBST içinde %50 metanol ile her yıkama için 10 dakika daha olacak şekilde iki kez tekrarlayın. Ardından, spesifik olmayan boyanmayı azaltmak için embriyoları %100 metanol içerisine aktarın ve en az iki saat inkübe edin.İnkübasyonun ardından, embriyoları rehidrate etmek için kuyucuklardaki metanolü pipetle çekerek atın. Önce PBST içerisindeki %50 metanol ile iki kez, ardından PBST içerisindeki %25 metanol ile iki kez, her biri 10 dakika olacak şekilde yıkayın. Son olarak, %100 PBST ile her seferinde 10 dakika olmak üzere iki kez yıkayın.Son olarak, boyanmış embriyoları dereceli yıkama serileri kullanarak PBST içindeki %80 gliserol çözeltisine aktarın ve doğru şekilde gerçekleştirildiğinde gözlem anına kadar dört derece Celsius'ta saklayın. İlgilenilen genin ekspresyonu, zebra balığı embriyosunda mor bir boyanın belirmesiyle belirtilir. Bu görüntü, kişiselleştirmeden 24 saat sonraki, AAL DH one A two'ya özgü RIBA probları ile hibridize edilmiş bir zebra balığı embriyosunu göstermektedir; gözlerde, arka beyinde, pektoral yüzgeç tomurcuğunda, ria ve somitlerde spesifik boyama görülebilir.Bu görüntü, FGF eight A için spesifik bir prob ile hibridize edilmiş, gelişiminin 13 somite evresindeki bir zebra balığı embriyosunu göstermektedir. Bu durumda, tline kelon, dorsal Dion, Kelon orta beyin, arka beyin sınırı, somitler ve kuyruk tomurcuğunda spesifik boyanma görülmektedir. Bu görüntü, PAX two A için spesifik bir prob ile hibridize edilmiş, döllenmeden 22 saat sonraki bir zebra balığı embriyosunu göstermektedir. Sinir sistemini görselleştirmek için yararlı, güçlü bir belirteçtir.Yöntem üzerinde uzmanlaşıldığında; koroid fissürde, orta beyinde, arka beyin sınırında, otik vezikülde ve spinal kord nöronlarında spesifik boyanma görülebilir. Bu teknik, ders programına bağlı olarak birkaç laboratuvar oturumuna yayılacak şekilde modifiye edilebilir. Eğitmen tarafından ders dışı zaman ve çaba gerekebilir.Bu videoyu izledikten sonra, bütün montaj ve C2 hibridizasyonunun lisans laboratuvarına dahil edilmesi fikrine daha sıcak baktığınızı umuyoruz. Öğrenciler bu becerileri geliştirdikçe, bu teknik hakkında bilgi sahibi olmaları, üst sınıflardaki veya lisansüstü araştırmalardaki deneyimlerine geçişlerini kolaylaştırabilir.

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Fare doku veri toplama maksimize etmek için farklı teknikler bir arada sunulmaktadır.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Öğrenin, Danio rerio embriyolarında gen ekspresyonu desenlerini gözlemlemek için tüm dağı in situ hibridizasyon (WISH) yöntemini. Bu teknik, moleküler biyoloji ve organizmal biyoloji arasında köprü kurarak gelişimsel biyoloji eğitimini güçlendirir.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet