Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell'ippocampo oltre durate a lungo

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il trasporto mitocondriale e i neuroni in coltura per lunghi periodi utilizzando la microscopia a fluorescenza su cellule vive. Ciò si ottiene marcando prima i mitocondri nei neuroni in coltura con una proteina fluorescente mirata all'organo L. La seconda fase della procedura consiste nell'acquisire immagini del trasporto mitocondriale in condizioni di controllo.

Il terzo passo della procedura consiste nell'acquisire una serie di immagini time-lapse del trasporto mitocondriale dopo la somministrazione acuta di neuromodulatori come la serotonina. La fase finale della procedura consiste nell'eseguire un'analisi della serie di immagini time-lapse acquisite. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che i neurotrasmettitori modulano il trasporto mitocondriale.

Tali risultati si ottengono solo con l'imaging di mitocondri marcati in fluorescenza nei neuroni per lunghi periodi. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come la marcatura dei coloranti vitali o la trasfezione transitoria della GFP, è che questo metodo rende possibile l'esecuzione di osservazioni a lungo termine del trasporto mitocondriale in neuroni sani in coltura. A dimostrare questa procedura sarà Chen, un collega associato del mio laboratorio, al fine di fornire un ambiente stabilmente riscaldato e umidificato.

L'incubatore con coperchio superiore dello stadio è collegato a un incubatore standard per colture tissutali tramite un circuito chiuso, coperchio a membrana A-P-F-T-E per piastre di coltura inferiori in vetro da 35 millimetri che consente lo scambio di gas tra la coltura neuronale e l'ambiente all'interno dell'incubatore. Insieme, queste e altre caratteristiche consentono l'osservazione a lungo termine di neuroni in coltura in varie condizioni sperimentali. Trasferire la piastra di coltura contenente neuroni ippocampali in coltura, che esprimono la proteina rosso mito turbo in una cappa di coltura tissutale.

Riposizionare il coperchio di plastica con il coperchio a membrana PFTE e spostare la piastra di coltura sul microscopio. Agganciare la base dell'incubatore al tavolino del microscopio, quindi posizionarla con cautela sul piatto di coltura coperto da membrana. Nell'apertura incassata, allineare l'involucro dell'incubatrice con i montanti in acciaio sulla base dell'incubatrice e abbassare l'involucro sulla base.

Serrare le viti a testa zigrinata fino a ottenere una buona tenuta tra l'involucro e la base. Accendere il controller della ruota portafiltri del microscopio, la sorgente luminosa e la fotocamera CCD prima di aprire il software di imaging. In questo protocollo, il libro delle diapositive cinque viene utilizzato per l'acquisizione delle immagini.

Passa a un obiettivo a immersione in olio 63 x e abbassa la torretta dell'obiettivo. Applicare con cautela l'olio da immersione sulla superficie dell'obiettivo. Fare clic sull'icona della finestra di messa a fuoco sulla barra degli strumenti e accendere la lampada in campo chiaro spostando il cursore della lampada.

Per regolare l'intensità della luce, acquisisci la messa a fuoco su un campo di cellule utilizzando gli oculari e trova una cellula di interesse. Selezionare il filtro XI tre nella scheda dell'oscilloscopio utilizzando gli oculari, trovare il piano di messa a fuoco per i mitocondri nelle cellule che sono state etichettate con la proteina rosso turbo mito, quindi passare alla telecamera CCD. Fare clic sull'icona di acquisizione dell'immagine sulla barra degli strumenti, iniziando con un tempo di esposizione iniziale di 100 millisecondi.

Trova l'esposizione ottimale utilizzando il test e trova i pulsanti migliori nella finestra di acquisizione. Nella casella Tipo di acquisizione. Selezionare l'opzione time-lapse e selezionare l'intervallo di imaging desiderato e la durata della sessione di imaging nelle opzioni di acquisizione time-lapse.

Avvia l'acquisizione di immagini time-lapse facendo clic sul pulsante di avvio nella parte inferiore destra della finestra di acquisizione. Dopo aver acquisito una sessione di imaging di controllo, somministrare neurotrasmettitori o altri reagenti attraverso le porte di iniezione sulla parte superiore dell'incubatore del tavolino. Dopo l'aggiunta dell'agonista del recettore della serotonina otto mitocondri precedentemente stazionari O-H-D-P-A-T-A indicati dalla punta della freccia si muove lungo l'assone del neurone ippocampale.

La velocità media e la direzionalità dei singoli mitocondri sono riassunte prima dell'aggiunta di serotonina. La maggior parte dei mitocondri sono stazionari, tuttavia, dopo l'aggiunta di serotonina, il 42% dei mitocondri ora mostra un movimento direzionale e percorre distanze maggiori rispetto a quelli che mostrano un movimento direzionale in assenza di serotonina. Al contrario, con l'aggiunta di dopamina, il 92% dei mitocondri è stazionario negli ultimi 15 minuti di una sessione di imaging dopo questa procedura.

È possibile eseguire altri metodi per monitorare più di un segnale al fine di rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, come l'attività del calcio e il trasporto mitocondriale nei neuroni sono correlati.