Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die in vivo Biolumineszenz-Bildgebung zu nutzen, um Immunantworten nach der Implantation von manipuliertem Herzgewebe (EHT) bei Ratten zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Luziferase-positive ehs erzeugt werden. Als nächstes werden EHS, die stabil Luciferase exprimieren, in das Omentum major der Empfängerratten transplantiert.

Anschließend kann eine In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung an Empfängertieren durchgeführt werden, um das nicht-invasive longitudinale EHT-Überleben und die Abstoßung zu überwachen. Mit diesem Modell können beispielsweise die Intensität und Kinetik der akuten Abstoßung mit der Abnahme der beobachteten Biolumineszenzsignalintensität im Laufe der Zeit korreliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Histologie besteht darin, dass tägliche Messungen eine nicht-invasive Längsschnittbeurteilung des Transplantatüberlebens ermöglichen.

Diese Methode kann Aufschluss über das Überleben und die Abstoßung von künstlich hergestelltem Herzgewebe geben, aber auch auf andere Fragestellungen angewendet werden. Zum Beispiel der Stoffwechsel von ehs. Die Bili-Technik wird von Christiana Parman demonstriert, die diese Technik täglich durchführt.

In meinem Labor werden transgene Herzzellen zunächst aus Luciferase Lu-Neugeborenen isoliert, um fibrinbasiertes DHT für Implantationszwecke zu erzeugen, einen Mastermix vorzubereiten, der Zellen enthält, die aus neonataler Luciferase, lu-transgen, Rattenherzen, Rinderfibrinogen und Matrigel zu X-D-M-E-M und NKM isoliert wurden. Bereiten Sie Arous-Gussformen vor, indem Sie neun Milliliter 2 % Aros in PBS zu jeder Vertiefung in sechs Vertiefungskulturschalen hinzufügen und dann Teflon-Abstandshalter in die Vertiefungen einsetzen. Nachdem der Aros fest geworden ist, entfernen Sie die Abstandshalter und legen Sie Silikonpfostengestelle auf die Kulturschalen, wobei der Stift in die Formen greift.

Um EHT zu erzeugen, mischen Sie den Master-Mix vorsichtig, fügen Sie dann eine berechnete Menge Thrombin in den Master-Mix hinzu und mischen Sie kurz. Pipettieren Sie dann schnell 1100 Mikroliter Mastermix in jede Form. Nachdem das Fibrinogen polymerisiert ist, entfernen Sie vorsichtig die Racks mit den Stiften, die jetzt haftendes EHT haben, aus den agros-Gießformen und übertragen Sie die Racks in neue Sechs-Well-Zellkulturschalen, die acht Milliliter speziell angefertigtes Medium pro Well enthalten.

EHT werden 10 Tage lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 7 % Kohlendioxid-Zellkultur aufbewahrt. Und das Medium wird dreimal pro Woche gewechselt. Während dieser Kulturperiode beginnen die Herzzellen neonataler Ratten, sich zu verlängern, zu verbinden und sich entlang der Kraftlinien zwischen den Silikonstiften auszurichten.

Zum Zeitpunkt der Implantation werden spontane kohärente Kontraktionen beobachtet. Sterilisieren Sie die Instrumente für die Operation vor der Verwendung im Autoklaven und erwärmen Sie 30 Milliliter sterile Kochsalzlösung. Ratten für die Implantation sollten 100 bis 150 Gramm wiegen und unter herkömmlichen Bedingungen mit Standard-Rattenfutter und Wasser ad libido untergebracht werden.

In diesem Video werden braune Wanderratten nach der Anästhesie verwendet, sedieren die Ratten vor der Operation und bestätigen die Sedierung durch fehlendes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen, während die Ratte unter Narkose steht, injizieren fünf Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, pflegen subkutan in die Planke, rasieren den Bauchbereich und tragen Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Augen des Tieres zu verhindern. Desinfizieren Sie während der Anästhesie den Bauchbereich mit Betadin und tupfen Sie dann mit 80 % Ethanol von sauber nach schmutzig ab. Wiederholen Sie diese Desinfektion.

Treten Sie dreimal auf, drapieren Sie das Tier und führen Sie einen Bauchschnitt in der Mittellinie durch, bei dem Haut und Muskeln in zwei Schritten getrennt werden, um den Bauch zu öffnen. Verwenden Sie die Heißperlsterilisation für Werkzeuge zwischen den Schnitten. Befeuchten Sie einen Puder-Freak-Handschuh mit der Kochsalzlösung.

Lege die Eingeweide in den Handschuh. Falten Sie den Handschuh um den Darm, um Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden. Spreizen Sie den Schnitt und legen Sie die Milz frei.

Erkennen und verteilen Sie den größeren Impuls mit einer Pinzette. Schneiden Sie das EHT vorsichtig von den hängenden Silikonstiften ab und übertragen Sie es auf den größeren Impuls. Wickeln Sie den größeren Schwung um das EHT und fixieren Sie es mit zwei Einzelnähten mit sieben oh Prolin.

Als nächstes verschiebst du den Darm zurück in den Bauch. Spülen Sie den Bauch mit einem Milliliter vorwarmer steriler Kochsalzlösung. Verschließen Sie die Muskelschicht der Bauchdecke mit sechs OH Prolin-Laufnähten.

Verwenden Sie fünf Oh Prolin-Laufnähte, um die Haut zu schließen, um eine ausreichende Analgesie für diese Art von Eingriff bereitzustellen. Bei 50 Milligramm pro 100 Milliliter Ole zum Trinkwasser für drei Tage nach der Implantation. Die IVUS Bioimaging Plattform wird für die nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung in vivo verwendet und die Ergebnisse werden mit der IVUS Living Image Software analysiert.

Die Bildgebung der Packung wird täglich durchgeführt, beginnend zwei Stunden postoperativ. Vor der Visualisierung der EHT-Biolumineszenz ist die Ratte zu betäuben und die Sedierung durch die Zehe zu bestätigen. Kneifen Sie den Bauchbereich desinfizieren.

Injizieren Sie zunächst Luzifer in einer Menge von 375 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht und legen Sie die anästhesierte Ratte in die IVU-Bildgebungskammer. Bis zu vier Ratten können gleichzeitig analysiert werden. Verwenden Sie die IVUS-Lebendbildsoftware, um das Peak-Signal zu beobachten und aufzuzeichnen, das etwa 20 Minuten nach der Lucifer-Injektion auftritt.

Bestimmen Sie dann die Ausgangssignalintensität von Luciferase-positiven Zellen innerhalb des EHT in Einheiten von Photonen pro Sekunde pro Quadratzentimeter pro Ceridian in der interessierenden Region, 120 Minuten nach der Implantation und an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10 und den Wochen zwei, drei und vier. Die Daten können in Diagrammform ausgedrückt werden, die die Signalintensität im Laufe der Zeit anzeigen. Die zellulären in vivo Immunantworten bei immunkompetenten Braunen, Norwegen und Immundefizienten.

Nacktratten wurden untersucht, nachdem SP-Zyten des EHT-Implantationsempfängers fünf Tage nach der EHT-Implantation entnommen worden waren. Die Interferon-, Gamma- und IL-Vier-Expression wurden mittels Lispa-Assays unter Verwendung von Mitomycin-inhibiertem EHT als Stimulatoren und fünfmal 10 der sechs Empfängerzyten als Responderzellen bewertet. Die Reaktionen auf TH eins und TH zwei waren im immunkompetenten Modell signifikant höher als im immundefizienten Modell, was durch die Produktion von Interferon, Gemma bzw. IL vier belegt wurde.

LUCIFERASE-positive EHS wurden entweder in das Omentum major von immunkompetenten PN-Ratten oder immundefizienten Nacktratten transplantiert. Das Zellüberleben wurde longitudinal von BLI verfolgt. Die Rate der Tiere, die das transplantierte EHS abgestoßen haben, wird dargestellt.

Alle BN-Ratten stießen die EHT-Transplantate schnell ab, während die Zelle bei T-Zell-defizienten Ratten überlebte. Einmal gemeistert, können Operationen innerhalb von Minuten durchgeführt werden, wenn die Technik nach der Operation richtig durchgeführt wird. Andere Methoden wie immunologische Aufsätze und Histologie können durchgeführt werden, um andere Fragen zur Zellinfiltration und Humerusreaktion zu beantworten.