初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

この手順の全体的な目標は、クロマチン、免疫沈降、またはチップアッセイで使用するためにE 8.5マウス胚を単離することです。これは、最初にマウス胚を単離し、単一細胞懸濁液を調製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、DNA結合タンパク質をゲノムDNAに化学的に架橋し、続いて超音波処理してDNAを断片化することです。

手順の3番目のステップは、タンパク質クロマチン複合体を免疫沈降させ、精製されたDNAを単離することです。手順の最終ステップは、精製された免疫沈降DNAを従来のPCRまたは定量的リアルタイムPCRによって分析することです。最終的には、発生中の組織や臓器における分化プログラムの開始中に、分化特異的遺伝子の調節配列とのタンパク質相互作用を示す結果を得ることができます。

今学期は、胚形成中の分化プログラムの開始に関する良い質問に答えるのに役立ちます 分化特異的遺伝子の調節配列と相互作用する調節因子の同定を通じて、それらが転写能力を持つようになるにつれて。この手順を開始するには、胚の8.5日目に犠牲にしたマウスから子宮角を取り出します。承認されたプロトコルに従って、組織はハサミを使用して新鮮な切片培地を含むペトリ皿に入れられます。

各移植部位を個別に切断し、新鮮な解剖培地が入ったペトリ皿に入れて、余分な血液を避けます。8本の鉗子で、各着床部位から子宮層を切除し、鉗子を使用して個々の胚を分離するde siduを露出させます。発生のこの段階では、胚は頭頂卵黄袋に囲まれており、これはデウム組織、内臓卵黄袋、および羊膜に接触します。

羊膜は、胚と直接接触している透明な膜です。内臓の卵黄袋は羊膜と頭頂卵黄の袋の間に位置し、胚を育てる顕著な血管の存在により、8.5〜9.5の胚を食べることで容易に区別できます。各胚を周囲の膜から取り出し、解剖培地を含む新しいプレートに個別に移して、余分な血液を取り除きます。

次に、各胚を200マイクロリットルの解剖培地を含む1.5ミリリットルのエイノアチューブに移します。単離された胚の均質化は、200マイクロリットルのコラゲナーゼを添加することから始まります。胚を含む各einorチューブに2つの溶液をタイプします。

摂氏37度のシェーカーで100RPMでサンプルを20分間静かに振とうします。次に、ペッティングしてサンプルを再懸濁し、細胞の塊を破壊します。1.5ミリリットルのeend rphチューブの上に置かれた40ミクロンのメッシュサイズの滅菌細胞ストレーナーの上部に細胞懸濁液を適用します。

すぐに600マイクロリットルの室温で1つのX-D-P-B-Sをセルストレーナーの上部に適用して、分離を完了します。懸濁液が緊張したら、細胞ストレーナーを廃棄し、サンプルを4, 000 Gで4°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清reusを捨てます。

各ペレットを1ミリリットルの室温に1つのX-D-P-B-Sで懸濁します。次に、サンプルを室温で1分間4, 000Gで遠心分離します。スナットを2回目に廃棄した後、各口蓋を200マイクロリットルの室温解剖培地に再懸濁し、200マイクロリットルのサンプルに5.6マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドを添加してクロマチンを架橋し、最終濃度1%ホルムアルデヒドにします。

インキュベーション後、サンプルを室温で10分間インキュベートし、サンプルを4, 000Gで摂氏4度で3分間遠心分離し、上清を廃棄します。1ミリリットルあたり80マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルまたはPICを含む1つのX-D-P-B-Sを冷やして細胞を再懸濁します。次に、サンプルを4, 000 Gで摂氏4度で3分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、サンプルはマイナス80°Cで凍結することができ、超音波処理の前に数ヶ月間安定しており、凍結した細胞ペレットを氷上で解凍するか、または前のステップからのペレットを氷上に置くことができます。再懸濁液後、細胞パレットを100マイクロリットルの室温SDS溶解バッファーに再懸濁します。さらに100マイクロリットルの室温SDS溶解バッファーを添加し、ピペッティングと反転によってサンプルを再懸濁します。

細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、架橋DNAを200〜500塩基対にせん断するようにレーターをセットアップします。このデモンストレーションでは、DIO geno bio rupture UCD 200を使用しています。

氷スラリーで囲まれたサンプルを超音波処理します。摂氏4度以上で温めたり、遠心分離機を凍結したりしないでください。4°Cで10分間14, 000Gでサンプルを超音波処理します。

上清を氷上で予冷した新しいeend DPHチューブに移します。超音波処理されたサンプルを最大5つのアリコートに分割します。1つのアリコートをマイナス20°Cで保存して、クロスリンク反転のための入力を予約します。

新たに添加されたPICを含むチップ希釈バッファーで他のアリコートを10倍に希釈します。まず、チップアッセイタンパク質に使用する抗体に基づいて、プレクリアに使用するエアロスピードを決定します。ここでは、チップに用いる抗体が狂犬病であるため、ビーズが使用されています。

希釈したスーパーインを、50%のサケ精子、DNA、タンパク質を75マイクロリットル加えて事前に透明にします。エアロスピードは、インキュベーション後1時間回転して摂氏4度でインキュベートし、サンプルを2、500Gで摂氏4度で1分間遠心分離します。仰臥位を新しいプレクールエンドDPHチューブに移します。

事前にクリアしたEloquaにサンプルあたり4マイクログラムの抗体を加え、回転させて摂氏4度で一晩インキュベートします。まず、60マイクロリットルのサケの精子、DNAタンパク質、エアロスビーズ懸濁液を各サンプルに加え、摂氏4度で1時間回転させてインキュベートします。サンプルを1000Gで摂氏4度で1分間遠心分離します。

遠心分離後。仰臥位を慎重に取り除き、DNAタンパク質ビーズ複合体を氷上に保持して廃棄します。Resusは、書面によるプロトコルに記載されているように、バッファー1から4を使用してパレットを吊り下げて洗浄します。

各洗浄は、回転による5分間のインキュベーション期間と、それに続く1000 Gでの1分間の遠心分離、および洗浄後の上清の除去で構成されます。Resusによってクロマチン抗体複合体を溶出 洗浄したクロマチンタンパク質ビーズ複合体を新たに調製した溶出緩衝液の250マイクロリットルで懸濁させ、各サンプルを5秒間激しくボルテックスし、次いでサンプルを室温で15分間インキュベートし、遠心分離後の回転で15分間、2, 500 Gで1分間。室温で、各溶出液を新しい eph チューブに移します。

elucianプロセスを繰り返し、同じephチューブ内の各サンプルの溶出液を組み合わせます。架橋を逆転させるには、各500マイクロリットルの溶出液に20マイクロリットルの5モーア塩化ナトリウムを追加します。以前に予約した入力制御には、ミリリットルあたり5 moer塩化ナトリウムを40マイクロリットル追加します。

EITを摂氏65度のウォーターバスで4時間加熱します。DNA断片のサイズを確認するために、0.1〜1キロベースペアにまたがるサイズマーカーの隣にある2%aerosゲル上のインプットコントロールで各サンプルの10マイクロリットルを一晩実行します。DNAは、鋭いバンドではなく、塗抹標本として現れます。

各500マイクロリットルのサンプルから、kaya quick gel抽出キットを使用してDNAを回収します。まず、600マイクロリットルのqgバッファーを添加して、カヤクイックスピンカラムのシリカメンブレンによるDNA吸収を最適化し、次にカラムをロードする前に200マイクロリットルのイソプロパノールを添加します。混合物をチェックして、SDS沈殿物が存在するかどうかを判断します。

SDS沈殿が発生した場合は、沈殿物が消えるまで、サンプルを摂氏42度の水浴で温める必要があります。次に、サンプルをカラムに塗布し、製造元の指示に従ってDNAを溶出します。SDSはPCRTポリメラーゼの活性を妨げる可能性があるため、PCRを実行する前に完全に除去する必要があります。

氷上で各DNAサンプルをインキュベートして残留SDSを沈殿させ、摂氏4度で1分間14, 000Gで遠心分離します。SANEを新しいeinorチューブに移します。DNA EITは、従来のPCRまたは定量的リアルタイムPCRまたはプライマー特異的なQPCRのいずれかによって検出することができます 分析する各配列について、1つのPCRまたはQPCR反応のために全DNA IITから5〜10マイクロリットルを使用し、PCRおよびQPCR条件は異なります。

ただし、出発物質の量が限られているため、従来のPCR検出には追加のPCRサイクルが必要であり、40サイクルから始めて必要に応じて調整する必要があります。このプロトコルを使用して、チップはE 8.5およびE 9.5胚の両方から行われました。チップ精製されたDNAは、従来のPCRおよび定量的リアルタイムPCRによって分析されました。

結果は、筋原性因子および調節因子がE 8.5およびE 9.5胚の筋原性およびプロモーター上に存在することを示しています。対照的に、筋原性が発現していないオーク嚢では、筋原性および筋原性およびプロモーターへの結合の兆候はありませんでした。筋原性結合部位に一致する配列を含むインターフェロンガンマプロモーターは、予想通りネガティブ配列制御として使用された 筋原性は、試験した組織サンプルのいずれにおいてもインターフェロンガンマプロモーターに結合していなかった。

結果は、筋原性がE 8.5およびE 9.5胚の体節の筋原性プロモーターに結合していることを示しています 筋素は、これらの段階では、このビデオを見た後、クロマチン沈殿物評価のためのEA 0.5マウス胚を分離し、調製する方法をよく理解する必要があります これは、組織開発中の組織特異的遺伝子に見られる調節因子を特定するものです。