Name: Travmatik Beyin Hasarı Eğitim için Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, Kolsky bar cihazı kullanarak travmatik beyin hasarı araştırmalarında nöronal hücrelere dürtüsel basınç uygulama yöntemini. Bu teknik, hücre hasarı mekanizmalarını incelemek için kontrollü basınç uygulaması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Travma Mekaniği Ordu-UNL Merkezi (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr Namas Chandra), UNL Layman Ödülü (26-1110-0033 -001 Yazarlar fon kaynaklarına teşekkür etmek istiyorum , PI: Lim).

1. Nöronal Hücre Kültürü <ol><li> Nöron hücreleri, astrositler, ve bunların eş-kültür dahil beyin hücreleri bir hücre modeli olarak kullanılabilir. Bir fizibilite gösterisi olarak, hücre hattı nöronal hücrelerin dürtüsel basınçlandırılması sunulmuştur. </li><li> SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde (ATCC, CRL-2266) 18 mm çapında cam lameller üzerine kültüre. Hücreler 3 yoğunluğunda ekilmiş olan × DMEM oluşan büyüme ortamı kullanılarak 10 3 hücre / cm 2% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye. Hücre kültürlerinde cam slaytlar 37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör tutulur </li><li> SH-SY5Y nöronal hücrelerin hücre farklılaşması elde etmek için, hücreler daha fazla medya ile 7 gün için 10 uM retinoik asit (RA) ile desteklenmiş ortam ile muamele edilir iki günde bir değiştirildi. 7. gün, hücreleri basınçlı olmaya hazırız. </li></ol> 2. Basınçlandırma Ekipmanı: Kolsky Bar <ol><li> Kolsky bar, de1949 yılında Kolsky 1 ile veloped, çok yüksek bir yükleme hızında bir malzemenin mekanik özelliğini ölçmek için kullanılmıştır. Cihaz çubuklar arasındaki temas halinde yerleştirilen bir örnek ile iki çubuk oluşur. Olay çubuğunda oluşturduğunuz bir stres dalgası, dalga yansıyan ve iletilen dalga böler örnek yayar. Örnek olarak gerilme iletilen dalga ile orantılıdır. Bu çalışmada, set-up Kolsky iki çubuk arasına yerleştirilmek üzere bir hücre basınç odası içermektedir. </li><li> Iki alüminyum alaşımlı bar (her 6 m uzunluğunda) hizalanmış pirinç rulmanlar tarafından askıya alınır, ve in vitro hücre basınçlandırma odasında bir bar arasında sıkışmıştır. Yukarı çubuğun bir ucu üzerine kenetlenir bir £ 130 kitle olayı çubuktur. Bir sürtünme kelepçesini, istenen darbe süresi sağlayacak bir konumda yer alır. Kelepçe çekici ve kütle ve bir yükleme desteği arasındaki makas kriko sıkarak, olayın bar kelepçe-kütle bölümü pre-cistenilen seviyeye ompressed. Bir hidrolik sistem ile ani bir mola için kelepçe kilitleyen bir taraklı cıvata zorlamak hızla önceden saklanan sıkıştırma serbest bırakır ve böylece bir basınç darbesi üretir. Bu olay çubuğu yoluyla yayar, test odası piston sürücüler ve düşüncesizce odasının içindeki sıvı ve hücreler hermetikler. Sırayla odası basınçlandırma bulaşan barda aşağı yayılan bir basınç nabız başlatır. Barlarda basınç darbeleri ile ilişkili suşlar 45 volt için heyecanlı bileşik yüksek direnci strain gauge ile ölçülür. Ölçer sinyalleri bir yükleme tarihi olarak 1 MHz frekansında bir dijital osiloskop ile kaydedilir. </li><li> İn vitro hücre basınç odasının içinde bir piston-silindir oluşur. Silindir 2.6 cm iç çapa ve 3.8 cm dış çapa sahiptir, ve boşluğunun tabanında dağılmış küçük bir delik vardır. Delik hücre örneği yükleme sırasında bir hava ve aşırı sıvı havalandırma olarak hizmet vermektedir. Piston 7.5 cm uzunluğundave aynı çubuk malzemeden imal edilir. Piston düşük sürtünme mühür olarak hizmet tesisatçı (Teflon) bant, iki ila üç kat sarılır. Uç kapağı uzunluğunda 32 mm ve yükleme sırasında cam lameller (hücreler kültüre edildiği) sabitleyen iki küçük paslanmaz çelik vidalar vardır. </li></ol> 3. Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma <ol><li> Tüm basınç odası parçaları otoklav kullanarak sterilize edilir ve UV ışık altında tutulur. Odasının montaj hücre kültürü başlık içinde gerçekleştirilir. Odasındaki havalandırma vidası gevşek boşluğunun dibinde havalandırma devreye girer. Önceden ısıtılmış (37 ° C), taze büyüme ortamı kabarcıkları yapmadan odasının içine pipetle konulur. Daha sonra, bir hücre-kültür cam slayt alınır, ve (dış kaplama hücreleri), pistonun kapak üzerinde yerleştirilmiştir. Küçük tutan vidaları yerine tutmak için slayt üzerine aşağı sıkılır. Bir hücre-kültürlü cam slayt ile piston takıldığında biraz into odasının boşluğu ve montaj yüksek noktada olmanın havalandırma ile hareket ettirildiğinde. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston ilk önce hava kabarcıkları, fazla sıvı dışarı zorlamak boşluğu içine itilir. Ya bir referans işareti veya jig her test için aynı kültür ortamı hacmi sağlamak için bir kılavuz olarak kullanılır. Bölme içinde ortam eksenel boyutu 6 mm kadardır. Havalandırma vidasını Sanitize ve sıkı hazne suyu yapmak için değiştirin. Kamara yaparsa, teflon sarma değiştirilmesi veya güçlendirilmesi gerekmektedir, bu statik yük altında sızıntı olmamalıdır. </li><li> Bu noktada, Kolsky bar sistemi sıfırlanır. Ağır kütle orijinal konumuna geri döndü ve yeni bir kilitleme vidası kullanılır (kırık) bir yerini alır. Yaklaşık 200 psi hidrolik yeni kilitleme cıvatasını takın. İstenilen değeri biraz daha yüksek bir basınca olayın bar ön yükleme bölümüne kadar sıkıştırmak için makas kriko kullanın ve sonra tam sürtünme meşgul onu gerikriko vida. Veri toplama artık silahlı. </li><li> Toplanan hücre basınç odasına sistem içine monte edilir. Bu küçük laboratuar makası girişi tarafından desteklenen bir V blok yerleştirilir ve iki bar ile hizalanır. Hafif bir yağ tabakası ve arasında herhangi bir hava boşlukları ortadan kaldırmak için birlikte butting yüzeyler ovmak yağlayın Her arabirim. </li><li> Testi artık devam etmeye hazır. Kelepçe kilitleme cıvatasını hızlı hidrolik kelepçe sürücüsü pompalayarak kırmak zorunda kalır. Sonuçlar kelepçe ayrı olacak ve veri toplama göstermelidir. Hücre basınç geçmiş iletilen çubuk ölçer ölçümü tespit edilir. Ikinci gönderilen çubuk yeterince uzun ise ölçümler bir negatif basınç göstermek durumlarda, bu sadece nokta için ilk rahatsızlık arasında olmalıdır. Bir kabarcık tutulur ise iletilen darbe süresi olay pulstan daha kısa olabilir. Büyüklük olay darbe bu ulaşmak mümkün olmayabilir, ama bu, bir yeterince lon olmalıdırboşaltma öncesinde g plato. Aksi takdirde, yalıtılmış bir bölmede veya montaj ve bir bar arasında bir hiza içinde büyük bir hava kabarcığı ya da oluşmuş olabilir. </li><li> Hücre basınçlandırma kamara sonra kaldırılır ve hücre kültürü kaputu içinde söktürür. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston odasının serbest çekilir. Hücre kültür cam slayt, pistonun uç alınır. </li></ol> 4. Basınçlı Hücre Davranışı Değerlendirme <ol><li> Basınçlandırma sonra, hücreler hemen kontrol edilebilir ya da daha fazla, daha sonra muayene için inkübe edildi. Uygun aseptik işlem süreçleri ile, uzun vadeli post-inkübasyon mümkündür. </li><li> Basınçlı hücreleri tüm moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri ile incelenebilir. Özellikle nöronal hücre basınçlandırma için, tahliller akson uzantısı basınç indüklenen değişiklikler, mikrotübül sitoskeletal değişiklik, nöronal gen expre değerlendirirken, TBI koşullarda hücresel ve moleküler fizyolojisi araştırmakSsion, apoptoz, vb yapılabilir. Kontrolü hücre örneklerinin, aynı kültüre hücrelerin, aynı süre için basınçlandırma odasının içinde tutulur, ancak basınçlı değil (yani, oda kontrolü denir) kullanılır gibi. </li><li> Akson uzantısı değişiklikleri değerlendirmek için, basınçlı ve oda kontrolü hücreler hemen basınçlandırma ve post-inkübasyon 1 ve 24 saat sonra optik mikroskopta incelenir. Nöronal hücre görüntü örneği 'Örnek' Sonuçları kesit (Şekil 2) 'de gösterilmektedir. Akson uzunluğu değişiklik aktin immünofloresan boyama ve görüntü analizi ile belirlenebilir. Hücreler% 0.05 v / v Tween-20 ile yıkama tamponu ile yıkanır bir% 4 w / v formaldehit çözeltisi ile çözülmüştür, ve bir% 0.1 h / h Triton X-100 çözeltisi ile permeabilize edilir. % 1 w / v sığır serum albümin ile bloke etme çözeltisi sonra, hücreler tetramethylrhodamine izotiyosiyanat (TRITC)-konjuge phalloidin ile inkübe edilir. Hücrelerin immünofloresan görüntüleri bir floresan ile alınırmikroskop ve basınçlı ve kontrol hücreleri için neurites uzunlukları ImageJ yazılım (NIH) kullanılarak ölçülür. </li><li> Neurites akson ya da dendrit olarak tespit edilebilir. Akson ya da dendrit meydana gelen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için, deney yukarıda açıklanan her yapı tespit antikorlar kullanılarak tekrar edilebilir, yani dendrit için akson ve mikrotübül ilişkili protein (map2) antikor nörofilament (NF) antikor. </li><li> Mikrotübüller nöronların önemli sitoskeletal bileşenlerinden biridir ve mikrotübüller hasar nöronal hasarın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. 2 Mikrotubul β-tubulin antikoru kullanılarak immunofluorescently canlandırılabilir. Hücreler, post-basınçlandırma 0 ve 24 saat sonra sabit β-tubulin antikoru ile boyandı ve floresan mikroskobu ile gözlenmiştir. </li><li> Nöronal ve apoptotik gen ekspresyonu dürtüsel basınçlandırma etkisini değerlendirmek için, toplam RNA basınçlı ve kontrol hücreleri elde edilir. GenE ifadesi bizim yayınlanan protokolleri benzer kantitatif RT-PCR veya gerçek zamanlı RT-PCR, yaparak muayene edilebilir. 3 </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Basınç profilinin bir örneği, basınç odasının içindeki hücreler için uygulanabilir. Kolsky çubuğu cihazı başarıyla yaklaşık 0,7 ms süre ile 2 MPa seviyesine, tek-pulse tipi impulsif basınçlandırma üretir. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. Dürtüsel basınçlandırma için nöronal hücre yanıtı bir örnek. SH-SY5Y hücreleri odasına kontrol hücrelere göre 2 MPa gösterisi ayrı nörit / akson dağılımına dürtüsel basınçlandırma maruz. 6. Zorluklar ve Çözümler <ol><li> Oda sızdırmazlık üstesinden gelmek için en büyük engellerden biridir. Bu foo-ringler çapında diskler oyma ve artan sürtünme bir sorun var ki und. Sürtünme etkileri ortadan kaldırmak, hem de oluk açma, Teflon tesisatçının bant ile piston bantlama basit bir yöntem önlemek için kullanılır. Bu problemleri çözer ve istenilen basınç seviyesi ve süresi üretir. </li><li> Basınçlı nöronal hücre davranışı, ikincil TBI mekanizması veya uzun vadeli etkileri değerlendirilirken, özellikle uzun bir post-inkübasyon süresinden sonra muayene edilmelidir. Hücre içeren odası, Kolsky bara geçmeden basınçlandırma ve hücre kültürü kaputu geri hareket ederken potansiyel koşulları steril maruz kalmaktadır. Odası parçaları ve / demontaj hücre kültürü kaputu içindeki hücre kültür slayt ve kamara, montajında ​​düzgün çalışması öncesi sterilizasyon ile uzun vadeli post-inkübasyon birkaç haftaya kadar mümkündür. </li><li> Verilerin tekrarlanabilirliği hücresel mekanik uyarım deneylerinde önemli bir parametredir. Bizim cihaz, reproducibilit içinnöronal hücre yanıtı y dürtüsel basınçlandırma istenen tercihi nasıl belirlenir, basınç seviyesi ve süresi hem de art arda elde edilir. Her basınçlandırma için elde edilen basınç profili kaydetmek yana, istenmeyen basınç profilden hücre yanıtı verileri el ile daha sonra bırakılabilir. </li><li> Haznesi montaj, transfer ve Kolsky bar, basınçlandırma, transfer-sırt ve kamara sökme monte dahil tüm basınçlandırma adımları, en az 10 dakika sürer. Sonraki hücreye kültürlü slayt önceki basınçlandırma hemen sonra basınçlı olabilir. Bu nedenle, basınç deneyler, yeterli sayıda etkin bir şekilde yapılabilir. Bizim set-up 18 mm çaplı cam lameller kullanır. Bir basınç deney alt tabaka boyutuna bağlı olarak immünoblot batı için yeterli protein (ve aynı zamanda kısmen basınçlı bazı hücreler ölü çünkü) sağlamaz. Yaklaşık üç tekrarlanan basınçlandırma deneyler immunobl için gerekli protein miktarını sağlamakOtting. Yine, tekrarlanabilirlik basınç profili ile her zaman kontrol edilir. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

In vitro deneysel teknikler çoğu TBI koşullarda beyin hücre hasarı incelemek için teşebbüs edilmiştir. Bunlar bu kısa süreli basınç TBI için hakim fiziksel faktör olduğu kabul edilmiştir / astrosit germe, akış kaynaklı kayma gerilmesi nöron, ağırlık düşürme, stylus laserasyonu, lazer transeksiyonu, litotripsi, vb 4,5 bulunmaktadır. Özellikle 6,7 , TBI patlamanın shockwave milisaniye bir düzenin bir puls süresine sahiptir. 4 Bu varsayım ve gözlem dayanarak, geçici basınçlandırma yeteneğine barometre haznesi gelişmiş ve TBH koşullarda beyin hücre davranışlarını değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Örneğin, sıvı perküsyon barotravma oda 0.5 MPa için yaklaşık 20-30 ms uzun süre ile kadar bir tepe basıncı ile ilgili bir basınç darbesi TBI&#39;dan altında insan glial hücre davranışını incelemek için kullanılmıştır. 6. Son zamanlarda, VandeVord ve ark. 7 kullanılan metal astrosit hücre incelemek topu çarpıcı barometre haznesiTBI altında davranış ama metal bilye çoklu basınç darbesi çarpıcı. Bu çalışmada, tek-pulse tipi dürtüsel basınçlandırma üreten bir roman hücre basınçlandırma cihaz geliştirdik. Cihaz bizim 8 ve diğer adlı çalışmalarda bir malzeme test cihazı olarak kullanılmaktadır Kolsky bar set-up, üzerinde geliştirilmiştir. Çok yüksek yükleme hızında 1,9 Kolsky barın malzeme test yeteneği edebilmek için modifiye edilmiştir Basınç odası (Şekil 1) içinde kültür hücreleri tek-pulse tipi basınç uygulayın. Biz başarıyla dürtüsel basınç büyüklüğünü ve süresini kontrol edebilecek. Temsili bir hücre tepki olarak, basınçsız odasının kontrol hücrelerine kıyasla 2 MPa basınç SH-SY5Y nöronal hücrelerde anlamlı akson ve akson kaybı görüntülemek göstermiştir. Sonuç olarak, biz özel tasarlanmış Kolsky kullanarak bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma cihazları geliştirilmiştirbar cihaz ve TBH koşullarında nöronal hücre yanıtını araştıran yılında potansiyel kullanımını gösterdi. Biz de bu tekniğin her hücre tipine çeşitli seviye ve süresini de dürtüsel baskılara maruz kalabileceği çok yönlü olduğunu unutmayın. Bu nedenle, cihazı hücrelerinin yaralanmasına için değil, aynı zamanda da pozitif olarak işlev ve kaderini tayin olarak hücre uyarıcı için değil, sadece, itici basınç ile indüklenen hücre mechanotransduction davranışını incelemek için kullanılabilir.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) insan nöroblastom hücrelerinde </li><li> 18 mm çapındaki cam lameller </li><li> Hücre kültürü ortamı: DMEM,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin </li><li> Indükleyici nöron için Retinoik asit (10 uM) </li><li> Kolsky bar dürtüsel basınçlandırma cihazı </li><li> Piston-silindir hücreli basınç odası </li><li> Piston üzerindeki hücre kültürlerinde lamel sabitlemek için paslanmaz çelik vidalar </li><li> Hücre odası ve Kolsky bar arasında arayüzler için Gres </li><li> Basınçlandırma (sabitleştirici, antikor, floresan boya, PCR malzemeleri, vb) hücre yanıtı değerlendirmek için genel moleküler biyoloji malzemeleri </li></ul>

travmatik beyin hasarı eğitim için nöronal hücre dürtüsel basınçlandırma

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama bağlı travmatik beyin hasarı (TBI) araştırmak için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir. Biz patlama TBI-ilgili dürtüsel basınçlandırma in vitro nöronal hücrelerin nasıl uygulanacağını Bu video makalede göstermektedir. Bu kaydedilen hücre basınç odası içinde tam basınç geçmişi olan, özel bir Kolsky çubuk aygıtı tarafından oluşturulan iyi kontrol edilen bir basınç darbesi kullanılarak elde edilir. Basınçlı nöronal hücrelerin basınçlandırma hemen sonra muayene veya ayrı akson kaybı görece indükler Biz yaklaşık 2 MPa Atmalı basınçlandırma gözlenen aksonal / akson uzantısı, nöronal gen ekspresyonu, apoptozis, vb dürtüsel basınçlandırma uzun dönemli etkilerini incelemek için daha inkübe edilir basınçsız hücreleri için. Bizim tekniği iyi kontrollü pr beyin hücrelerinin dürtüsel basınçlandırma aracılığıyla TBI patlamanın hücresel / moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir yöntem sağlarbüyüklüğü ve süresi essure.

Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama-indüklenen travmatik beyin hasarının hücresel / moleküler mekanizmalarının araştırılması için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir.

Travmatik Beyin Hasarı Eğitim için Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma

Blast kaynaklı travmatik beyin hasarını (TBI) incelemek amacıyla, Kolsky bar cihazı kullanılarak yeni bir impulsif hücre basınçlandırma deneyi geliştirilmiştir. ...

Bu prosedürün genel amacı, travmatik beyin hasarı çalışması için kültürlenmiş beyin hücrelerine impulsif basınç uygulamak ve bunu gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle retinoik asit kullanılarak kültürlenen hücrelerin nöronal diferansiyasyonunun indüklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöronal hücreler ksky bar tabanlı hücre basınçlandırma cihazına yerleştirilir ve blast kaynaklı travmatik beyin hasarı ile ilgili büyüklük ve sürede impulsif basınca maruz bırakılır.Son olarak, hücre hasarlarını ve travmatik beyin hasarının olası mekanizmalarını değerlendirmek amacıyla hücrelere moleküler biyoloji analizleri uygulanır. Mikroskobik inceleme sonuçları, 2 megapascal büyüklüğünde ve 0.7 milisaniye süreli impulsif basınçlandırmada nöronal hücre ölümü ve nörit aksonal yapı kaybı olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin sıvı perküsyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, negatif basınç bölümlerinin olmaması ve süre süresinin iyi kontrol edilebilmesidir.Bu yöntem, impulsif basınç, büyüklük, süre ve yükleme şeklinin bir fonksiyonu olarak nöron hücre ölümü veya hasarı için eşik değer gibi, travmatik beyin hasarı (TBI) alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem şimdiye kadar grubumuz tarafından blast kaynaklı TBI'yi incelemek için kullanılmış olsa da, darbe kaynaklı TBI gibi diğer travmatik beyin hasarı türleri için de kullanılabilir. Prosedür, Profesör Chen fang'in laboratuvarından lisansüstü öğrenci Matthew ve benim laboratuvarımdan teknisyen li ha tarafındanle gösterilecektir.Bu deneyde, hücre basınçlandırma düzeneği olarak yapılandırılmış bir Ksky bar kullanılmaktadır. Düzenek, hizalanmış pirinç yataklarla asılmış iki adet altı metrelik alüminyum alaşımlı çubuktan ve bir in vitro hücre basınçlandırma odasından oluşur. Çubukların arasına yerleştirilen hücre basınçlandırma odası, bir piston silindirinden meydana gelmektedir.Silindirin boşluğunun tabanında, hücre örneği yerleştirilmesi sırasında havayı ve fazla sıvıyı tahliye eden küçük bir delik bulunmaktadır. Piston, çubukla aynı tüpten yapılmıştır ve iki veya üç kat Teflon bant ile sarılmıştır. Uç kapak, cam lamelleri iki küçük paslanmaz çelik vida ile sabitler.Bu demonstrasyonda SH SY five Y insan nöroblastoma hücreleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, protokol birçok hücre modeli kültürüne uygulanabilir. Hücreler, 18 milimetre çapındaki cam lameller üzerine santimetrekare başına 3000 hücre yoğunluğunda ekilmiştir.Hücreleri inkübe ederken, besiyerine yedi gün boyunca her iki günde bir değiştirilmek üzere 10 micromolar retinoic acid ekleyerek DMEM'de farklılaşmalarını tetikleyin. Yedinci günde hücreler, iyi gelişmiş nörit aksonal yapı sergiler ve basınç uygulanmaya hazır hale gelir. Basınç odasının tüm parçalarını otoklav kullanarak sterilize edin ve oda kurulumu sırasında parçaları UV ışığı altında muhafaza edin.Bir kültür kabininde, haznedeki havalandırma vidasının hava çıkışına gevşek bir şekilde yerleştiğinden emin olun. Boşluğun tabanında, hazneyi taze hazırlanmış sıcak büyüme ortamı ile doldurun. Ardından, hücreler dışa bakacak şekilde, hücre kültürü yapılmış bir cam lamı piston kapağına vidalayın ve pistonu dikkatlice hazne boşluğuna yerleştirin.Havalandırma vidasını çıkarın, havalandırma ağzını yukarı doğru eğin ve pistonu oda içerisindeki önceden belirlenmiş referans çizgisine kadar itin. Bu işlem, hücre basınçlandırma odası içinde yaklaşık altı milimetrelik bir sıvı derinliği bırakır. Kabarcık oluşumundan kaçının, havalandırma vidasını sterilize edin ve odayı sızdırmaz hale getirmek için vidayı tekrar yerine takın.Hazne, statik yük altında sızdırmamalıdır. Ksky bar sistemini sıfırlayın. Ağır kütleyi orijinal konumuna geri getirin ve kilitleme cıvatasını yerine takın.Kilitleme cıvatası, pimler kırılana kadar gelen barın hareketini önleyen bir sıkıştırma kuvveti sağlar. Yeni kilitleme cıvatasını hidrolik kriko ile yaklaşık 200 PSI değerine getirin. Gelen barın ön yükleme bölümünü, istenen değerden biraz daha yüksek bir basınca getirmek için makaslı kriko kullanın ve ardından JAK vidasının tam sürtünmesini sağlamak için geri çekin. Basınçlandırma yaklaşık bir milisaniye sürdüğü için şimdi veri toplama sistemini ayarlayın.Bir Wheatstone köprüsü devresinde 2000 ohm'luk gerinim ölçerler kullanarak bir megahertz'lik bir örnekleme frekansı ayarlayın. Voltaj, iletim çubuğunda 45 volt olarak ayarlanmalıdır. Hücre haznesini, piston iletim çubuğuna bakacak şekilde monte edin.Hücre haznesini, küçük laboratuvar makas krikosu tarafından desteklenen ve iki çubukla hizalanmış bir V bloğuna yerleştirin. Her bir arayüzü hafifçe yağlayın ve birbirine nazikçe sürterek temas eden yüzeyler arasındaki havayı giderin. Sistem şu an hazır durumdadır.Veri toplama sistemini etkinleştirin ve hidrolik klemp sürücüsünü hızla pompalayarak testi gerçekleştirin. Bu işlem kilitleme cıvatasının kırılmasını sağlayarak klembin ayrılmasına ve hücrelere bir basınç dalgasının iletilmesine neden olur. Testten sonra, lamı kültür kabininde odağından çıkarın ve hücre davranışının değerlendirilmesine geçin.Deneyimle beraber, düzenek saatte yaklaşık dokuz hücre kültürü lamına basınç uygulamak için kullanılabilir. Okuma analiz edilirken, iletilen çubuk sinyalinin başlangıcında hava kabarcığı hataları görülebilir, ancak bu gösterimde bunlar görülmemektedir.Geçirgenlik çubuğu yeterince uzunsa, en önemli veriler ilk bozulma ile başlamalı ve ölçümlerin negatif basınç gösterdiği yerde sonlanmalıdır; bu voltaj okuması, strain gauge analizi yoluyla hücrelerin maruz kaldığı strese orantılıdır. İletilen darbenin süresi, gelen darbeden daha kısa olabilir. Hücre basınçlandırma odasındaki sıvıya küçük bir hava kabarcığı hapsolursa, iletilen darbenin genliği gelen darbeninkini aşmayabilir ancak boşaltmadan önce yeterince uzun bir platoya sahip olmalıdır.Aksi takdirde, ya sızdırmaz hazne içinde büyük bir hava kabarcığı kalmıştır ya da düzenek ile bar hizalanmamıştır. Basınçlandırmanın ardından hücreler hemen incelenebilir veya daha sonraki incelemeler için inkübasyona devam edilebilir. Basınçlandırılmış hücreleri, aynı şekilde işlem görmüş ancak basınçlandırmaya tabi tutulmamış hazne kontrol hücreleriyle karşılaştırın ve inkübasyon sonrası çeşitli zaman noktalarında optik mikroskopi ile nörit uzunluğundaki değişimleri değerlendirin.Aktin immünofloresan boyama,le sitoiskeletsel değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, mikrotübül ilişkili protein iki (MAP2) antikoru, temel nöronal belirteçlerden birindeki değişiklikleri görselleştirmek için kullanılabilir.İmpulsif basınçlandırmanın nöronal ve apoptotik gen ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, istenirse R-T-P-C-R gibi standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanın. İmmünobloting için yeterli hücre lizatı, aynı basınca maruz bırakılmış birkaç hücre örneğinden toplanabilir. Bu örnekte, basınçlandırma profilinde, ksky bar aparatı, optik mikroskop görüntülerinde görüldüğü üzere, kültürlenmiş nöronal hücrelere yaklaşık 0,7 milisaniye süreli, iki megapascal seviyesinde tek darbeli impulsif basınç başarıyla uygulamıştır; iki megapascal impulsif basınca maruz kalan SHSY five Y insan nöronal hücreleri, basınçlandırılmamış kontrol hücrelerine kıyasla belirgin nörit akson yıkımı göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, hücrelerin gelişim sonrası negatif basınca maruz kalmaması için sıvı basınçlandırma odasını her zaman bu şekilde tutmalı ve asla şu şekilde tutmamalısınız. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların, kontrollü basınçlandırma koşulları altında travmatik beyin hasarının hücresel mekanizmasını incelemelerinin yolunu açmıştır. Army UNL Center for Trauma Mechanics'ten sağlanan finansal destek için teşekkür ederiz.

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, orta hat kafatası kesisi yaparak, kafatasını delerek ve beyin korteksini ortaya çıkarmak için kemik flecini çıkararak ve travmayı indüklemek için yüksek basınç uygulayarak bir farede açık kafatası travmatik beyin hasarına neden olma prosedürünü göstermektedir. Yara daha sonra fare modelini sonraki deneylere hazırlamak için dikilir.

Bir Çarpma Probu Kullanarak Travmatik Beyin Hasarı Fare Modeli Oluşturma

In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Travmatik beyin yaralanmaları (TBH'ler) ciddi bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Kontrollü kortikal darbe cerrahisi modeli kullanılarak, TBH'nin etkileri ve olası tedavi yöntemleri üzerine araştırmalar yapılabilir.

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Bu kağıt birincil patlama travmatik beyin hasarı roman modeli açıklar. Sıkıştırılmış hava tahrikli şok tüpü vitro fare hipokampal dilim kültürler için tek bir şok dalgası ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu tekrarlanabilir beyin doku hasarı ile yüksek üretilen iş üreten bir basit ve hızlı bir protokoldür.

Patlama travmatik beyin hasarı roman Vitro modeli

Burada, ex vivo vasküler reaktivite belirlenmesi izole, basınçlı, kemirgen orta serebral arter (MCA) parçaları kullanarak birincil patlama travmatik beyin hasarı (bTBI) takip yöntemleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. bTBI indüksiyon bir şok tüp, bir gelişmiş patlama simülatörü (ABS) aygıtı olarak da bilinen kullanılarak yapılır.

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Burada, Yetişkin, erkek Wistar fareler içinde lateral sıvı perküsyon hasarı (FPı) modeli ile şiddetli TBı teşvik etmek için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, sürekli video-EEG kayıtlarını toplamak ve travma sonrası epileptogenesis ile tutarlı epileptiform deşarj için monitör kullanmak üzere bir kablosuz telemetri sisteminin kullanımını da gösteriyoruz.

Yan sıvı perküsyon kaynaklı travmatik beyin yaralanması sonrasında epileptiform deşarj Izlemek için kablosuz video-EEG sisteminin kullanımı

Burada açık kafa kontrollü kortikal darbe ile murine travmatik beyin hasarı indüksiyon için bir protokol açıklar.

Travmatik Beyin Hasarı İndüksiyonu için Kontrollü Kortikal Etki Murine Modeli

Burada, hafif ila orta dereceli travmatik beyin hasarının nörobiyolojik ve patofizyolojik etkilerini araştırmak için kemirgenler için bir patlama dalgası modeli protokolü sunuyoruz. Patlamaya bağlı hafif ila orta dereceli travmatik beyin hasarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlayan basınç sensörleriyle donatılmış, gazla çalışan, tezgah üstü bir kurulum kurduk.

Kemirgenlerde Kapalı Başlı Hafif Travmatik Beyin Hasarının Preklinik Değerlendirmesi için Düşük Yoğunluklu Patlama Dalgası Modeli

Serebral kontüzyonun eşlik ettiği intraparankimal kanama ve nöroinflamasyon ciddi ikincil beyin hasarını tetikleyebilir. Bu protokol, araştırmacıların kanama, kontüzyon ve travma sonrası bağışıklık tepkilerini incelemelerine ve potansiyel terapötikleri keşfetmelerine olanak tanıyan fare kontrollü bir kortikal etki (CCI) modelini detaylandırır.

Travmatik Kanama, Konkontüzyon ve Nöroinflamasyon için Preklinik Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Burada, fareler kullanılarak tekrarlanan düşük yoğunluklu patlama maruziyetleri üretmek için yöntemler sunulmaktadır.

Farelerde Yüksek Derecede Tekrarlayan Düşük Seviyeli Patlama Maruziyetinin Modellenmesi

Bu protokol, farelerde oküler, beyin ve omurilik travmaları dahil olmak üzere kapalı sistem merkezi sinir sistemi (CNS) yaralanmalarını indüklemek için tasarlanmış özel bir aşırı basınçlı hava sistemini açıklar. Bu protokolün amacı, araştırmacıların benzersiz CNS travma çalışmaları için sistemi kolayca uyarlamaları ve genişletmeleri için bir çerçeve sağlamaktır.

Odak, Kapalı Sistem Merkezi Sinir Sistemi Yaralanması Sistemi

Öğrenin, Kolsky bar cihazı kullanarak travmatik beyin hasarı araştırmalarında nöronal hücrelere dürtüsel basınç uygulama yöntemini. Bu teknik, hücre hasarı mekanizmalarını incelemek için kontrollü basınç uygulaması sağlar.

Travmatik Beyin Hasarı Eğitim için Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma

Daha fazla video keşfet