Name: 카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 발광 생물리포터 파지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 Yersinia pestis를 발광 리포터 파지를 이용해 신속하게 검출하는 방법을. 이 기술은 세균성 병원균 식별과 생물안전 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건원의 중소 기업 혁신 연구 프로그램 (NIAID, 1R43AI082698 - 01)과 식량 농업의 국립 연구소 USDA (NIFA, 2009-33610-20028)에 의해 지원되었다.

1. Y. pestis 플레이트 접종 <ol><li> 리크 Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) Luria - Bertani에 재고 문화 (LB) 한천 (밀러). 무균 기술을 사용하여 모든 Y.을 수행 클래스 II 타입 biosafety 캐비닛. Y. pestis의 조작에 pestis A1122은 BioSafety 수준 (BSL) 2 제외를 선택 에이전트 부담입니다. 그것은 모두 75킬로바이트 쌍은 낮은 칼슘 플라스미드 응답 (LCR) 독성 및 독성에 필요한 PGM의 로커스 부족하다. Y. 그로 28 pestis ° C 공기 배양기를 제어 정적 온도 48 H하십시오. 와이의 성장률 pestis는 H 9 1.25의 세대 시간 느립니다. </li></ol> 2. Y. pestis 액체 미디어 접종 <ol><li> 단일 Y.을 전송 멸균 금속 접종 루프를 사용하여 LB 제품 국물 2 ML을 포함하는 멸균 17 X 100mm 문화 튜브에 pestis 콜로니. 균일한 크기의는 식민지를 선택하고, 다른 식민지는 지표이며, 명확하게 접시에있는 식민지의 나머지 부분에서 분리됩니다. 소용돌이 간략 튜브 28에서 문화를 성장 ° C 떨고 인큐베이터 (225 RPM)에 약 20 H하십시오. </li></ol> 3. Y. pestis의 파생물, 기자 파지 추가하고, 발광 생물 검출 <ol><li> 밤새 Y.을 희석 pestis 문화 50 ML 팔콘 튜브에 신선한 LB의 국물 (예 : 매체의 9.5 ML로 세포 500 μL)로 1시 20분과 ° C (225 RPM) 잡고 28 성장. 0.2 600 NM (600)에서 광학 밀도 (약 5 H)에 도달할 때까지 성장합니다. 적극적으로 성장 세포는 발광 생물 응답 호스트 박테리아의 생존 및 피트니스에 상관이다 transduce로 파지의 능력부터 감지 바람직합니다. 그럼에도 불구하고, 탐지 시스템은 성장주기 7 모든 단계에서 수확 전지와 호환되도록 표시되었습니다. </li><li> 2 % N - 지구장의 솔루션을 준비하여 발광 생물 반응에 필요한 기판을 생성합니다. LB의 국물의 9.8 ML과 N - 지구장의 200 μL를 섞습니다. 5 S. 위해 적극적으로 소용돌이 프라임 2퍼센트 N - 지구장의 솔루션 2 ML과 microplate luminometer 주입기. luminometer 잘하고 다음 각 microplate에 지구장의 솔루션을 67 μL를 autoinject 즉시 10 S.에 대한 샘플을 읽을 사전 설정된 </li><li> 3 문화 튜브에 LB의 국물 1 ML aliquots 하는걸. 각각의 튜브에 기자 파지 주식 솔루션 (5 X 10 9 플라크 형성 단위의 주식 [PFU] / ML) 20 μL를 추가, 파지 및 미디어 혼자 샘플은 부정적인 제어 역할을합니다. 와이의 부재에 pestis 세포는 기자의 파지의 추가는 발광 생물 반응을 이끌어해서는 안됩니다. </li><li> Y. 1 ML aliquots 하는걸 6 문화 튜브에 pestis 문화 (단계 3.1에서). 문화 (테스트 문화)의 3 기자 파지 주식 20 μL를 추가합니다. 나머지 세 문화는 '셀 혼자'대조군 (배경 autobioluminescence)로 제공하고 있습니다. 간략 vortexing으로 문화를 믹스하고, 각 샘플에서 수확 200 μL (시간 0 읽기)과 흰색 96 - 웰 플레이트 microtiter로 분배. 28에 남아있는 문화를 품어 ° C를 (225 RPM) 잡고. </li><li> microplate의 luminometer를 사용하여 bioluminescence (상대적인 빛의 단위, RLU)에 대한 시간 0 명 샘플을 측정합니다. </li><li> 10 일 이후 각 샘플의 수확 200 μL, 20, 30, 40, 50, 그리고 60 분 후 기자 파지 추가하고, bioluminescence에 대한 샘플을 측정합니다. 경우 Y. pestis 세포가 존재, 기자의 파지는 특히 세포에 바인딩의 DNA를 삽입하고, luxAB 기자 유전자 (그림 1)을 녹음하고 번역하는 호스트에게 transcriptional과 translational 기계를 사용합니다. </li><li> 신호의 강도와 신호 응답 시간은 현재 세포의 수에 비례합니다. 셀 (10 5 -10 8 CFU / ML), 컨트롤에 비해 RLU에 상당한 증가의 높은 농도에서 20 분 이내에 분명해야합니다. 낮은 세포 농도에서, (10 2 -10 4 CFU / ML), RLU 크게 증가 40-60 분 이내에 분명해야합니다. </li><li> 또는, Y. 필요없이 탐지 과정을 진행할 수 있도록 갓 어른이 접시에서 pestis의 파생물, 식민지 직접 기자의 파지를 숨겨주 LB의 국물 200 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 (vortexing으로) 혼합 수 있습니다. microtiter 접시에 잘으로 셀 / 파지 혼합 분배. 28 ° C에서 microtiter 접시를 부화하고 60 분 (단일 시점 전용) 이후 bioluminescence에 대한 샘플을 참조하십시오. </li></ol> 4. 대표 결과 : 기자 파지의 대표적인 시간 코스 실험 Y.의 검색을 중재 pestis는 그림 2에 그려져 있습니다. 1의 부정적인 컨트롤) 파지 혼자 (NO 세포), 또는 혼자서 2) 전지 (NO 파지) 60 분 병원 전반에 걸쳐 약 20 RLU의 bioluminescence의 기본 수준을 제공합니다ubation (기준 레벨 luminometer의 특정됩니다.) 대조적으로, 테스트 샘플 (기자의 파지 및 세포)에 대한 bioluminescence의 증가 파지 추가 후 15 분 분명하다. 신호 강도는 60 분 이상 꾸준히 증가한다. 연장 기간 (80 분)에 대한 Incubations는 호스트 세포의 중재 용해를 파지에 의한 피크 신호​​로부터 거부하는 신호가 발생합니다. 비슷한 결과는 37 배양 온도를 얻을 수있다 ° C에도 Y.을위한 최적 온도 pestis 성장 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 와이의 파지 - 중재 발광 생물 검출 pestis. 시간이 0, 기자의 파지와 세포가 28 ° C에서 incubated, 혼합되었고, bioluminescence가 (RLU) 시간이 지남에 모니터됨. RLU 크게 증가 (* 학생 T - 테스트, P &lt;0.05) 15 분 이내에 분명하다.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 빠르게 Y.을 감지하기 위해 기자 파지의 능력을 보여줍니다 기자 파지 이후 pestis는 교양 Y까지 발광 생물 신호 응답을 transduce 수 파지 추가 후 20 분 이내에 pestis 세포. 기자 파지도 직접 Y. 검출이 가능합니다 절연 이후 재배 7 전제 조건없이 임상 매트릭스에 pestis. 일반적으로 완료 48 H를 필요로하는 표준 파지의 용해 assays에 비해, 이것은 크게 검색 시간을 감소시킵니다. 이전 연구는 야생 형 ΦA1122의 파지는 거의 모든 천연 Y.을 lyse 수있는 증명 pestis는 격리하고, Y.에 대해 &#39;구체적인&#39;입니다 pestis 6,10,11 있지만, 일부 Y. pseudotuberculosis의 변...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Difco의 LB 한천, 밀러 </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB 국물, 밀러 </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 X 100mm 문화 튜브 </td><td> 미국 과학 </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> N - 지구장의 </td><td> 시그마 </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> 베리타스 microplate의 luminometer </td><td> 터너 Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite microtiter 96 - 웰 플레이트 </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis의 및 바실러스 anthracis는 각각 1, 역병과 탄저병의 원인이되는 대리인하는 세균성 병원균 카테고리입니다. 두 질환 '의 자연 발생 지금은 비교적 드문이지만, 분류된 생물학 무기 이러한 병원균을 사용하는 테러 집단의 가능성은 현실입니다. 질병의 고유한 communicability, 신속한 임상 과정, 높은 사망률 때문에 그것은 확산이 빠르게 감지하는 것이 중요합니다. 따라서 빠른 감지 및 진단을 제공하는 방법은 공중 보건 조치 및 위기 관리의 활성화의 즉각적인 이행을 보장하기 위해 필수적입니다. 재조합 기자 파지는 Y.의 검색에 대한 신속하고 구체적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다 pestis와 B. anthracis가. 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 현재 이러한 세균 병원균 2-4 확인 식별에 대한 고전적인 파지의 용해 assays를 사용합니다. 이러한 assays는 자연스럽게 자신의 세균 호스트에 대한 구체적이고 lytic 아르 파지를 발생 활용합니다. 특정 파지의 존재에 재배 세균의 하룻밤 성장 후, plaques (세균 용해)의 형성은 박테리아 타겟의 긍정적인 식별을 제공합니다. 이러한 assays는 강력한 있지만, 그들은 세 가지 결점으로 고통 : 1) 그들은 실험실을 기반으로, 2) 그들이 의심되는 시료에서 세균 분리 및 배양을 필요로하고, 3) 그들은 완료하는 데 2​​4-36 H 가져가라. 이러한 문제를 해결하기 위해 재조합 "빛을 태그"기자 파지는 유전자 Y.의 게놈에 장염 harveyi luxAB의 유전자를 통합하여 설계되었습니다 pestis와 B. anthracis 특정 파지 5-8. 그 결과 luxAB 기자의 파지는 빠르게하여 특정 목표를 감지할 수 있었다 (분 이내) 및 sensitively받는 세포에 발광 생물 표현형를 부여. 중요한 것은 감지 재배받는 세포 또는 모의에 감염된 임상 표본 7 중 얻은 것입니다. 데모를 위해, 우리가 알려진 Y.의 파지 - 중재 검출하는 방법을 설명 pestis는 CDC 전염병 진단 파지 ΦA1122 6,7 (그림 1)에서 만들어진 luxAB 기자 파지를 사용하여 분리. 사소한 수정 (성장 온도와 미디어 예 변화)와 유사한 방법, B.의 검색에 사용할 수 있습니다 anthracis은 B.를 사용하여 분리 anthracis 기자의 파지의 Wβ : luxAB 8. 방법은 재배 Y까지 biolumescent 표현형의 파지 - 중재 전달을 설명합니다 이후 microplate의 luminometer를 사용하여 측정 pestis 세포. 전통적인 파지의 용해 assays를 통해이 방법의 주요 장점은 사용, 빠른 결과를, 그리고 96 - 웰 플레이트 microtiter 형식으로 동시에 여러 샘플을 테스트하는 기능의 용이성이다. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 검색 설계도. 파지를 예제와 함께 혼합되어, 파지는 세포, luxAB가 표현되며, 세포를 감염 bioluminesces. 샘플 처리가 필요하지 않습니다, 파지와 세포가 혼합되고 이후 신호를 측정.

우선 세균성 병원균의 식별을위한 간단한 방법은 유전자 조작 기자 파지를 사용하는 것입니다. 자신의 특정 호스트 수종와 관련된 이러한 기자의 파지는 빠르게 호스트 세포에 발광 생물 신호 응답을 transducing 수 있습니다. 여기에, 우리는의 검출에 대한 기자의 파지의 사용을 설명<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

Yersinia pestis와 Bacillus anthracis는 각각 페스트와 탄저병의 원인균이며, Category A 세균성 병원체로 분류됩니다 1. ...

Yesinia Pestis와 Bacillus Anthrax는 각각 페스트와 탄저병의 원인균인 카테고리 A 세균성 병원체입니다. 현재 두 질병의 자연 발생은 비교적 드물지만, 테러 집단이 이러한 병원체를 생물학 무기로 사용할 가능성은 실재합니다. 이 영상에서는 yersinia pestis를 검출하고 식별하는 방법을 시연합니다.먼저, 미생물을 농업용 플레이트와 액체 배지에서 배양합니다. 다음으로, y pesti 특이적 리포터 pH를 배양액에 첨가합니다. 이 리포터 pH의 게놈에는 박테리아 루시페라아제인 luxe AB를 인코딩하는 유전자가 포함되어 있습니다.Y. pestis 세포가 존재하면, 리포터 파지가 세포에 특이적으로 결합하여 luxe AB 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 주입하며, 숙주의 전사 및 번역 기전을 사용하여 luxe AB 리포터 유전자를 전사 및 번역합니다. 그 결과 샘플이 생물 발광 표현형을 획득한 것이 확인되며, 이는 미지의 미생물이 Y. pestis로 양성 확인되었음을 나타냅니다. 전통적인 파지 용해 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 Y. pestis를 검출하고 확인하는 데 소요되는 시간이 며칠이 아닌 몇 분으로 단축된다는 점입니다. 이 방법은 분리 배양물뿐만 아니라 복잡한 임상 또는 환경 샘플에서 직접 Y. pestis의 존재를 신속하게 식별하고 검출하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 시사점은 페스트 진단으로 확장될 수 있는데, 이는 해당 질병이 증상 발현 후 24시간 이내에 치료되지 않으면 대개 치명적이기 때문입니다. 따라서 긍정적인 예후를 위해서는 Yesenia pests의 신속한 식별이 필수적입니다. 거의 모든 박테리아 종에 대해 파지가 존재하므로, 이 방법론은 Y pestis와 마찬가지로 의학적, 환경적 또는 농업적으로 중요한 모든 종에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.A 1122는 생물안전 2등급(BSafety Level 2)의 제외된 선택 약제 균주입니다. 이 균주는 병원성에 필요한 75 Kilobase Perlo 칼슘 반응 또는 LCR 병원성 플라스미드와 PGM locus가 모두 결여되어 있습니다. 이 절차는 멸균 기술을 사용하여 2등급 A형 생물안전 작업대 내에서 Y pestis A 1122의 획선 도말(streak)부터 시작하십시오.여기에 표시된 대로 LB agar에 보존 균주를 도말합니다. 플레이트를 뒤집어 28°C의 정적 온도 조절 공기

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis 감염의 생체 내 검출을 위한 리포터 효소 형광(REF) 이미징을 보여줍니다. 감염된 마우스는 REF 이미징을 위해 복강내 기질을 주입합니다. 박테리아 β-락타마제 효소에 의해 가수분해되면 기질은 형광을 방출하며, 이를 감지하면 감염 평가에 도움이 됩니다.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection(세균 감염의 생체 내 추적을 위한 Reporter Enzyme Fluorescence Imaging)

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장.

브레 너머 단계 : 언 바운드 흥분에 의한 형광 발광에서 (연료)

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

학습하세요 Yersinia pestis를 발광 리포터 파지를 이용해 신속하게 검출하는 방법을. 이 기술은 세균성 병원균 식별과 생물안전 연구에 활용됩니다.

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 '발광 생물'리포터 파지

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