Name: Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per isolare varianti di virus RNA con polimerasi a fedeltà alterata. Questa tecnica utilizza mutageni selettivi e sequenziamento per identificare mutazioni che modificano la frequenza di errore durante la replicazione virale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della ricerca medica e sanitaria sovvenzione da parte del Comune di Parigi, la nazionale francese concedere ANR-09-JCJC-0118-1, e l&#39;ERC Starting Grant Progetto RNAvirusPopDivNVax no. 242719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Scelta di linee cellulari. L&#39;efficacia degli analoghi base come l&#39;RNA mutageni si correla con l&#39;assorbimento da parte relativa da diversi tipi di cellule 11. Se la linea cellulare che viene normalmente utilizzato per il passaggio del virus si rivela refrattaria alla mutageno assorbimento o troppo sensibile (ad alta tossicità cellulare), può essere necessario utilizzare un&#39;altra linea cellulare che risponde a questi requisiti ed è ancora permissiva per la replicazione virale. Una volta che la variante resistenza mutageno è isolato, il resto della caratterizzazione può essere eseguita in originale, linea cellulare preferito. Nella nostra esperienza, le cellule HeLa facilmente prendere mutageni; cellule BHK richiedere fino a concentrazioni superiori di 10 volte e le cellule Vero sono refrattari ad assorbimento mutagene. Scelta del mutageno. Nel tentativo di isolare le varianti fedeltà da un trattamento mutageno, la probabilità di successo aumenta se più di un tipo di mutageni. Base mutageni analogico di diversa struttura, che vengono erroneamente incorporati nel genoma durante la replicazione sarà prevalentemente indurre risultato in uno specifico sottoinsieme di mutazioni nei successivi cicli di replica: trattamento ribavirina favorisce GtoA e mutazioni transizione CtoU 12; 5-azacitidina ha una distorsione simile, con la aggiunta di CtoG e trasversioni GtoC 13, 5-fluorouracile preferenzialmente induce transizioni Atog e UtoC 14. In alternativa, concentrazioni più elevate di Mg 2 + o Mn 2 + può essere integrato al mezzo per aumentare la frequenza complessiva mutazione del virus a RNA, senza il pregiudizio di cui sopra 12. A seconda del codone sequenze del virus &#39;, e il codone cambiamenti necessari per generare una variante fedeltà, alcune di queste condizioni favoriscono l&#39;emergere di questa variante rispetto agli altri. Per il poliovirus G64S maggiore fedeltà e virus Coxsackie A372V, ribavirina più facilmente selezionati per le varianti, perché il passaggio Atog richiesta presso il sito codone corrispondeva alle mutazioni prevalentemente generato da questa ribavirina. MOI vs dimensione della popolazione. In virologia, i protocolli per l&#39;infezione dei tessuti cultura prestare particolare attenzione alla molteplicità di infezione (MOI), per evitare l&#39;accumulo di particelle difettoso interferenti (basso MOI) o per promuovere ricombinazione tra virus (alto MOI), per esempio. Per selezionare gli eventi emergere oltre seriale passaging, è importante considerare anche la dimensione della popolazione virus. Dal momento che il mutante resistente si registri inizialmente a bassa frequenza, è meglio trasferire il maggior numero di abitanti il più possibile da un passaggio all&#39;altro (10 5 -10 6 virus, ad esempio) per evitare di perdere queste varianti emergenti, ad ogni passaggio. Scaling up la dimensione del bene o del matraccio (numero di cellule infette) può aiutare a minimizzare l&#39;aumento di MOI se questo è motivo di preoccupazione. D&#39;altra parte, per esperimenti in cui la sensibilità di un virus mutageno viene testato, a basso infection MOI è effettuata al fine di aumentare il numero di cicli di replica che si verificano durante l&#39;esperimento e per evitare salvataggio di genomi mutagenizzate by genomi di fitness più elevato attraverso complementazione in co-cellule infette. Questo è importante in quanto le mutazioni generate genomi progenie durante il primo turno di replica non sarà immediatamente rilevato. La maggior parte di questi RNA mutagenizzate saranno ancora confezionato in virione. E &#39;nel prossimo ciclo di infezione che le mutazioni letali presenti in questi genomi si tradurrà in un ciclo di replicazione interrotta, e la riduzione del titolo virus. Può essere necessario per consentire varie tornate di accumulo di mutazioni lordo di un effetto significativo di mutagenesi letale si osserva. Infine, se rispetto alla serie passaggio in presenza del mutageno, il virus titoli continuano a scendere fino ad estinzione, allora il ricercatore dovrebbe cercare passaging virus in quantità via via crescente del mutageno (a partire da una concentrazione molto bassa). L&#39;isolamento e la generazione del clone RNA mutageno resistente dal mutageno resistente popolazione RNA. Mutageni RNA introdurre molteplici mutazioni casuali ad ogni genoma, ma la selezione per la resistenza solo arricchire (e fix per sequenza consenso) la mutazione di resistenza. Per individuare questa mutazione, abbiamo sequenza della popolazione resistente mutageno (consenso della popolazione) e non i singoli virus. Quindi, il singolo, le mutazioni casuali generati dal mutageno non vengono rilevati nella sequenza, ma solo le mutazioni che si traducono in cambiamenti consenso seguito di selezione, si trovano. Nella nostra esperienza abbiamo solo identificare uno o due di tali modifiche apportate alla sequenza consenso. Una volta che la popolazione resistente mutageno è ottenuta e la mutazione di resistenza è identificato, è necessario generare un magazzino più puro di questa variante. Soprattutto, abbiamo descritto una procedura di purificazione targa. In alternativa, se il virus di interesse non produce placche facilmente identificabili, la variante desiderata può essere purifIED limitando la diluizione. Questo approccio è essenzialmente un 50 TCID in formato a 96 pozzetti, dove viene diluito lo stock del virus in modo tale che meno del 50% dei pozzi sono infetti. Utilizzando questa diluizione, lo stesso approccio di cui sopra è presa, in isolamento fino a 10 singole varianti e confermando le loro sequenze. Come accennato, nel migliore dei casi, un clone cDNA infettive del ceppo virale è disponibile. Isolamento della variante non sarebbe quindi necessario. Nella nostra esperienza, le varianti fedeltà sono il risultato di singole sostituzioni di aminoacidi e può quindi essere generati utilizzando semplici, kit di mutagenesi commercializzato come QuikChange (Agilent). Una opzione secondaria è quella di utilizzare un clone cDNA di un ceppo strettamente correlate. Tuttavia, se un ceppo correlata è utilizzato, consigliamo vivamente di utilizzare sia questo approccio e l&#39;isolamento del virus (ad esempio la purificazione della placca), perché abbiamo scoperto che la stessa mutazione fedeltà alterando su due virus strettamente correlati non sarà necessariamente lo stesso effetto. Fedeltà e la replica. Selezione di RNA varianti resistenti mutageno hanno portato l&#39;isolamento di entrambe le varianti superiori e inferiori fedeltà con caratteristiche di crescita che sono simili alle loro controparti di tipo selvatico 4,12,15. Attualmente, il legame tra tasso di attività della polimerasi e la fedeltà non è del tutto chiaro. Studi in vitro utilizzando biochimici purificato RNA polimerasi hanno mostrato che versioni successive hanno un tasso di fedeltà lavorazione più lenti, mentre le varianti più bassa fedeltà tendono ad avere una più rapida elaborazione 1-3,12. In coltura, queste differenze non sono di solito evidenti, il che suggerisce che la disponibilità di risorse, piuttosto che l&#39;attività cinetica intrinseca polimerasi, è il fattore limitante. Se la variante fedeltà replica con cinetica che non sono significativamente diversi da wild-type, poi un confronto tra le loro frequenze mutazione può essere fatto direttamente. Se un cambiamento molto significativo in cinetica replica esiste, allora i dati dovrebbero essere normalizzati per spiegare le differenze cinetiche, per esempio confrontando i virus che hanno subito lo stesso numero di cicli di replica. Nella nostra esperienza, sebbene non significative differenze in un unico passaggio-cinetica di crescita sono state osservate tra wild-type e le varianti ad alta fedeltà, abbiamo osservato che l&#39;alta fedeltà varianti costantemente titolo superiore (entro 1 log) rispetto al wild-type, ma fanno un po &#39;meno di RNA (entro dello stesso ordine di grandezza), inoltre suggerisce che il genoma producono contengono un minor numero di mutazioni e quindi sono più contagiose. Preparazione del campione e sequenziamento. Per tutte le misure di questi protocolli, è indispensabile che ad alta fedeltà, correzione di bozze enzimi vengono utilizzati per la PCR e RT-PCR per limitare l&#39;introduzione di ulteriori mutazioni, poiché non possono essere distinti da mutazioni biologicamente rilevanti. E &#39;fondamentale che le popolazioni di virus da confrontare sono stati preparati nelle stesse condizioni (passaggio storia, la cultura media dei tessuti, la temperatura, metodo di estrazione RNA, RT-PCR protocolli, ecc) È altresì importante garantire che il materiale di partenza era abbastanza ottenuto dalla estrazione di RNA in modo tale che una band forte è generato mediante RT-PCR. A 1 / 100 di diluizione del campione di RNA deve anche dare una rilevabile RT-PCR banda, indicando che il campione contiene un numero sufficiente di molecole di RNA per evitare distorsioni di rappresentanza (amplificazione del genoma stesso più volte). Dal momento che la frequenza di mutazione è una distribuzione, ci si aspetterebbe che i valori simili si ottengono indipendentemente dalle dimensioni della popolazione, a condizione che il pregiudizio di cui sopra non si sta verificando. Come mostra la figura 6 mostra, a 10 5 volte diluizione di uno stock del virus dà una frequenza di mutazione che non è significativamente diverso dal magazzino dei genitori. Fino a quando le condizioni ottimali per TopoTA clonazione si trovano, confermano la presenza di inserti in seguito ad un&#39;analisi blu / bianco, da colonia PCR prima sequenza. Come controllo per il rumore mutazione (mutazione introdotta mediante RT-PCR e sequenziamento), clone di un prodotto di PCR da un cuscinetto plasmide e la stessa sequenza virale / o clonare e sequenziare i prodotti RT-PCR di RNA in vitro trascritto corrispondente al genoma del virus (da consapevoli del fatto che diversi degli enzimi di trascrizione in vitro hanno tassi di errore diversi e non possono dare informazioni utili per l&#39;errore di fondo reale nella procedura). Alcune sequenze del virus può essere tossico per i batteri, quindi è importante verificare questo prima di decidere sulla regione del genoma virale ad essere sequenziato per la frequenza di mutazione. Nell&#39;analizzare sequenze ottenute da TopoTA, si noti che ogni clone dovrebbe contenere un solo inserimento / sequenza. Se un doppio picco si osserva, suggerendo una popolazione mista, è possibile che due colonie batteriche vicini sono stati selezionati. E &#39;anche possibile, anche se altamente improbabile date le basse frequenze di mutazione in replica batterica, che la mutazione è stata introdotta durante l&#39;amplificazione del plasmide nella coltura batterica. In p placcaurified popolazioni, un doppio picco può rappresentare placche si sovrappongono, o un virus che sta acquisendo una nuova mutazione o il ripristino di una mutazione nel corso dello sviluppo della placca. Siate coerenti e decidere se contare o meno contare queste mutazioni. Infine, tenere presente che le frequenze di mutazione usato qui sono valori relativi. Essi sono validi solo nel confronto tra popolazioni di virus coltivati ​​nelle stesse condizioni, e sequenziato più della stessa regione! Essi non devono essere presi come valori assoluti di tasso di mutazione, o la frequenza di mutazione del genoma nel suo complesso. Tuttavia, quando le condizioni sono controllate, che lo permettono riproducibili, il confronto quantitativo delle differenze nella distribuzione di mutazione e di frequenza.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracile </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Blu tripano </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA clonazione kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange mutagenesi kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Se un clone cDNA infettive è disponibile </td></tr><tr><td> 96-bene miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> O il software di allineamento altri </td></tr></tbody></table>

isolamento di varianti di virus rna fidelity e caratterizzazione di frequenza virus mutation

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Virus a RNA uso RNA polimerasi RNA dipendente di replicare i loro genomi. Il tasso di errore intrinseco elevato di questi enzimi è un grande contributo alla generazione di diversità demografica estrema che facilita l&#39;adattamento e l&#39;evoluzione del virus. Crescente evidenza mostra che i tassi di errore intrinseco, e le frequenze di mutazione risulta, di virus a RNA possono essere modulati da sottili cambiamenti di aminoacidi per la polimerasi virale. Anche se esistono test biochimici per alcuni polimerasi RNA virale che permettono una misura quantitativa della incorporazione fedeltà, qui descriviamo un metodo semplice per misurare le frequenze di mutazione del virus a RNA, che ha dimostrato di essere più precisi approcci biochimici per identificare le mutazioni alterano la fedeltà. L&#39;approccio utilizza le tradizionali tecniche di sequenziamento virologici e che possono essere eseguite nei laboratori di biologia più. Sulla base della nostra esperienza con un certo numero di virus diversi, abbiamo identificato i passaggi chiave che deve essere ottimizzato per aumentare la probabilità di isolare varianti fedeltà e la generazione di dati di significatività statistica. L&#39;isolamento e la caratterizzazione di mutazioni fedeltà alterare in grado di fornire nuove intuizioni nella struttura e la funzione della polimerasi 1-3. Inoltre, queste varianti fedeltà possono essere strumenti utili nella caratterizzazione dei meccanismi di adattamento e di evoluzione del virus 4-7.

Il presente articolo descrive i passaggi necessari per isolare e caratterizzare l&#39;RNA polimerasi varianti fedeltà dei virus a RNA e come utilizzare i dati di frequenza di mutazione per confermare le modifiche fedeltà in coltura.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

I virus a RNA utilizzano RNA polimerasi RNA-dipendenti per replicare i propri genomi. L'elevato tasso di errore intrinseco di questi enzimi contribuisce in modo significativo a...

I virus a RNA utilizzano RNA polimerasi codificate dal virus stesso per replicare i loro genomi. Queste polimerasi presentano una percentuale di errore intrinsecamente più elevata, che consente al virus di adattarsi ed evolversi rapidamente. Questo video presenta un metodo ottimizzato per analizzare e identificare virus con mutazioni nella loro RNA polimerasi che influenzano la percentuale di errore o la fedeltà durante la replicazione.Per prima cosa, i mutageni vengono applicati alle cellule ospiti virali per determinare il livello massimo di mutageno utilizzabile senza uccidere le cellule o inibire il virus. Una volta stabiliti i parametri ottimali, il virus viene passaggiato sotto la pressione selettiva di mutageni dell'RNA. La popolazione resistente al mutageno viene quindi sottoposta a sequenziamento per identificare la mutazione responsabile.Successivamente, si isola il mutante resistente al mutageno. Si monitorano la cinetica di replicazione e i risultati mostrano aumenti o diminuzioni della fedeltà della polimerasi. Contestualmente, si osserva una resistenza ampia ai mutageni RNA e alterazioni nella frequenza di mutazione della popolazione virale.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli acidi di fedeltà biochimica utilizzando polimerasi purificate, è che queste tecniche sono valide per qualsiasi virus a RNA che possa essere coltivato in coltura tissutale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, come il ruolo della polimerasi nell'adattamento e nell'evoluzione virale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché le pressioni selettive che utilizzano sono troppo forti o troppo deboli, e la dimensione del campione di sequenza analizzata della regione e il numero di cloni non sono stati ottimizzati per garantire un'adeguata potenza statistica.Iniziare questo esperimento determinando il range di concentrazioni del mutageno che possono essere utilizzate nei successivi esperimenti senza provocare la morte cellulare. Aspirare il mezzo da sei piastre a pozzetto contenenti monocapate subconfluenti di cellule hilar. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo supplementato con mutageno, impiegando i mutageni ribavirina, 5-fluorouracile, 5-azacitidina, cloruro di magnesio e cloruro di manganese.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, ogni 24 ore per i successivi due o sette giorni, utilizzare una piastra di cellule per verificare la vitalità mediante esclusione del blu di triam. Utilizzando un citometro ematico, calcolare la percentuale di cellule vitali per ciascuna concentrazione di mutageno, inclusi i controlli non trattati che determinano una mortalità cellulare inferiore al 50% al termine dell'infezione.Quando vengono raggiunte le titolazioni massime ideali, il passo successivo della procedura consiste nel determinare la concentrazione del mutageno che eserciterà una pressione selettiva ottimale senza ipermutare la popolazione alle concentrazioni appropriate. Ogni genoma viene mutato in almeno una o due posizioni. Il mutageno genererà quindi la mutazione di resistenza, che verrà successivamente selezionata durante il passaggio.Se vengono introdotte troppe mutazioni, i mutanti portatori della mutazione di resistenza risulteranno essi stessi letali. L'agenti mutageni impediscono il loro isolamento in piastre a sei pozzetti seminate con le. Le nostre cellule in due millilitri di mezzo integrato con agente mutageno utilizzano lo stesso intervallo di concentrazioni di prima, escludendo quelle concentrazioni che hanno determinato oltre il 50% di morte cellulare.Incubare per due ore per consentire l'assorbimento del mutagene dopo l'incubazione. Aspirare il mezzo e infettare con il virus a bassa multiplicità di infezione in 200 microlitri, incubare per 15-60 minuti per permettere al virus di infettare le cellule, agitando la piastra a intervalli regolari per assicurare che l'inoculo ricopra uniformemente il monostrato cellulare. Aspirare il virus inoculato e lavare due volte con due millilitri di PBS per rimuovere quanta più parte possibile dell'inoculo.Quindi aggiungere il mezzo contenente il mutageno in ogni pozzetto e incubare le cellule per un periodo corrispondente a tre-sei cicli di replicazione, solitamente da due a sette giorni. Raccogliere il virus da ogni pozzetto ed eseguire un saggio standard di placche o una diluizione limite per determinare l'effetto antivirale sul titolo virale calcolato. Identificare la concentrazione di mutageno che riduce i titoli virali rispetto all'infezione di controllo non trattata di 0,5-2 log, ma che non risulti altamente tossica per le cellule.Idealmente, con una tossicit&agrave; inferiore al 50%, per isolare varianti resistenti ai mutageni si inizia passando il virus in cellule ospiti in presenza della concentrazione ottimale di ciascun mutageno; il virus potrebbe dover essere passato fino a 30 volte e, ad ogni passaggio, &egrave; necessario titolare il virus e ripetere l'infezione e l'incubazione in presenza del mutageno come illustrato qui. I titoli virali dei campioni trattati con mutageni dovrebbero diminuire durante i primi passaggi rispetto al titolo virale originale e ai titoli del controllo non trattato. Una volta che i titoli virali di una determinata serie raggiungono un'entit&agrave; paragonabile a quella dei controlli non trattati, ci&ograve; suggerisce lo sviluppo di resistenza.Estrarre l'RNA virale per il sequenziamento utilizzando primer che amplificano i geni della polimerasi o della replicasi del virus di interesse. Generare il DNAc del genoma virale mediante RT-PCR, quindi sequenziare il DNA. Una volta ottenute le informazioni sulla sequenza.Utilizzare un software di allineamento per allineare le sequenze risultanti con il consenso di riferimento e identificare le nuove mutazioni puntuali. Inoltre, verificare i cromatogrammi alla ricerca di picchi minoritari che potrebbero essere stati trascurati dal software di allineamento. Un mutante che rappresenti dal 20 al 30% della popolazione totale si presenterà comunque come un picco, ma di dimensioni troppo ridotte per essere riconosciuto come un nucleotide misto mediante analisi di sequenza standard. Per identificare la mutazione di interesse, cercare polimorfismi a singolo nucleotide che compaiono esclusivamente nella popolazione trattata con mutageno rispetto al controllo non trattato, proveniente dallo stesso passaggio, come mostrato qui. Una volta identificata una mutazione, la variante resistente deve essere rigenerata da CD NA infettivo oppure isolata in coltura tissutale, e il fenotipo di resistenza deve essere confermato.Qui isoliamo i mutanti identificati mediante saggio di placca. Preparare diluizioni seriali del campione resistente all'azoto e aggiungerle a monocapate cellulari in piastre a sei pozzetti per un saggio di placca, dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Aggiungere un sovrastrato di agarosio da due a cinque giorni dopo l'infezione.Le placche devono essere chiaramente visibili. Idealmente, una delle piastre produrrà da 10 a 50 placche ben distanziate. Segnare la posizione delle placche sulla piastra con un punto, utilizzando un pennarello, avendo cura di non spostare o staccare il sovrastrato; inserire delicatamente una punta filtrante P200 attraverso il sovrastrato di agarosio.Per raggiungere la placca, sollevare con attenzione la punta dal sovraspalmato e trasferire il tappo di aros in una provetta da microcentrifuga contenente 250 microlitri di mezzo. Una quantità sufficiente di virus verrà trasferita indipendentemente dal fatto che il tappo di aros venga rilasciato dalla punta; vortexare la provetta e portare a trattamento per 10X per ute. Conservare una porzione del campione per amplificare successivamente il virus vivo.Quindi estrarre l'RNA dal resto del campione ed eseguire la R-T-P-C-R per identificare il campione di placca che contiene la mutazione desiderata. Sequenziare il CDNA. Assicurarsi che non siano presenti mutazioni aggiuntive.Successivamente, preparare una scorta più ampia di questo virus per tutti gli studi successivi. Poi confermare la resistenza conferita dalla mutazione identificata. Ripetere il saggio mutageno utilizzando diverse condizioni mutagene.Se la variante è resistente a più agenti mutageni, probabilmente presenta una fedeltà aumentata. Poiché le mutazioni che alterano la fedeltà si localizzano nella polimerasi, è fondamentale confermare che la cinetica di replicazione non sia significativamente modificata. Prima di determinare le frequenze di mutazione, esaminare la replicazione mediante almeno due approcci complementari.Ad esempio, un approccio che esamina la produzione di virus, come il saggio di placca o il TCID 50, può essere eseguito in aggiunta a un approccio che esamina la sintesi di RNA, come la R-T-P-C-R quantitativa o il northern blot. Successivamente, per confermare che la modifica della polimerasi identificata, responsabile della resistenza all'agente mutageno, altera la replicazione, si misurano le frequenze di mutazione per fedeltà. Questo può essere eseguito sia sulla popolazione di virus infetti che su quella totale di virus.Per determinare le frequenze di mutazione dell'intera popolazione virale, che comprende varianti vitali e non vitali, estrarre l'RNA ed eseguire l'amplificazione mediante R-T-P-C-R di una regione di 800-1.200 nucleotidi di una sequenza codificante nota per presentare varianti genetiche, ad esempio quella che codifica per una proteina strutturale. Successivamente, clonare mediante topo TA il prodotto purificato per ciascuna popolazione virale da studiare. Selezionare 96 colonie identificate come portatrici di un inserto positivo mediante selezione bianco-blu su piastre rivestite con xga.Eseguire una PCR su singola colonia per confermare la validità della selezione bianco-blu. Utilizzando la dimensione del frammento e le condizioni indicate sopra, circa il 90% delle colonie dovrebbe risultare positivo. Per ogni colonia bianca positiva, utilizzare un bastoncino per trasferire ciascuna colonia in un millilitro di terreno LB in 96.Le piastre di coltura batterica vengono incubate tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante. Il giorno successivo, isolare il DNA preparando minipreparazioni in formato 96 pozzetti, sequenziando ogni piastra con quantità sufficiente di primer per ottenere la massima copertura del segmento clonato.Dovrebbero essere sufficienti due primer con un'ampiezza di 600 basi. Eseguire l'analisi della sequenza utilizzando una sequenza di riferimento o consenso per ciascuna popolazione e un software di allineamento appropriato in grado di identificare facilmente i polimorfismi a singolo nucleotide. Cercare il software man da DNA star laser.Il gene viene utilizzato innanzitutto per scartare sequenze di scarsa qualità, come quelle con chiamata di basi errata su molte estremità o quelle troppo corte in lunghezza. Allineare le sequenze rimanenti. Identificare il range di nucleotidi coperto da tutte le sequenze nell'analisi.Eliminare le linee che non sono completamente coperte in questa regione. Per motivi di confronto, è essenziale che la stessa regione sia interamente coperta. Identificare e contare i polimorfismi a singolo nucleotide che differiscono dal ceppo di riferimento.Calcolare la frequenza delle mutazioni dividendo il numero totale di polimorfismi a singolo nucleotide per il numero totale di nucleotidi sequenziati. Riportare questo valore come numero medio di mutazioni ogni 10.000 nucleotidi sequenziati. Se lo stesso polimorfismo a singolo nucleotide appare in un elevato numero di cloni, presentare due valori che includano o escludano queste mutazioni ripetute.Determinare la distribuzione delle mutazioni. Creare un elenco ordinato del numero di cloni in ciascuna popolazione che presenta 0, 1, 2, 3 e così via mutazioni nella regione sequenziata, come opzione.Utilizzare le sequenze modificate per calcolare tutti i possibili confronti a coppie all'interno di un campione, al fine di ottenere i valori medi della diversità della popolazione. Sono disponibili diversi programmi di allineamento. Il programma di analisi genetica molecolare, noto anche come mega, viene utilizzato per determinare le condizioni ottimali per la selezione della resistenza alla mutagenesi dell'RNA.Le nostre cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di ribavirina e infettate con il virus Cox AKI B di tipo selvaggio a un indice di infezione (MOI) di 0,01, 48 ore dopo l'infezione. Il virus progenitore è stato raccolto e il titolo è stato determinato mediante TCID50. Questo grafico indica la percentuale di cellule sopravvissute al trattamento al di sotto dell'asse x, valutata mediante colorazione con blu di tripano a 48 ore dall'infezione.I risultati mostrano che concentrazioni di 100 e 200 micromolar riducono il titolo virale da uno a due log senza influenzare la vitalità cellulare. Per selezionare popolazioni resistenti al mutageno, il virus CHI ganga è stato passaggiato in cellule hilar in presenza barre grigie o assenza barre nere di 50 micromolar di ribavirina; dopo ogni passaggio, la progenie virale è stata quantificata mediante saggio classico di placche su cellule BHK come mostrato qui. L'effetto mutageno è evidente durante i primi passaggi, in cui il titolo virale trattato è diminuito di due log.Gradualmente Titus è tornato a livelli normali non trattati. Non si osservano differenze significative in cinque popolazioni trattate con mutageni rispetto a quelle non trattate, suggerendo che sono stati selezionati varianti resistenti. Effettivamente, il sequenziamento ha identificato mutazioni uniche nella popolazione virale sottoposta a trattamento con ribavirina. Per confermare una resistenza ampia a mutageni RNA di struttura diversa, la variante ad alta fedeltà A 3 72 V del virus COA B tre, inizialmente isolata nel test, è stata valutata per una sensibilità ridotta a diverse concentrazioni dei mutageni RNA ribavirina, cinque fluorouracile e cinque azacitidina.Le nostre cellule sono state trattate con le concentrazioni indicate di ribavirina e infettate con il virus Cox AKI di tipo selvaggio B a una multiplicità di infezione di 0,01, 48 ore dopo l'infezione. Il virus progenie è stato raccolto e i titoli sono stati determinati mediante TCID50. Qui vengono mostrati i titoli del tipo selvaggio e della variante A372 in funzione della concentrazione del mutageno. La variante A372V presenta costantemente titoli più elevati rispetto al tipo selvaggio.In tutte le condizioni testate per determinare la cinetica di crescita in un unico passaggio della produzione virale, le nostre cellule sono state infettate con una multiplicità di infezione di 10 con l'uno o l'altro dei seguenti virus: ceppo selvatico, variante ad alta fedeltà A372V o variante con replicazione difettosa CX64 del virus Coxsackie B3. Nei tempi indicati, la progenie virale è stata raccolta da cellule e supernatanti mediante cicli di congelamento e scongelamento e titolata con il metodo TCID50. L'aumento di fedeltà della variante A372V non coincide con un difetto replicativo osservabile in coltura tissutale. La variante CX64 presenta un significativo ritardo nella cinetica di replicazione e raggiunge titoli massimi inferiori di 1000 volte rispetto al virus selvatico.Utilizzando l'approccio descritto in questo video, ogni clone sequenziato deriva da un genoma unico all'interno della popolazione totale di virus e presenta quindi mutazioni uniche. Questa figura mostra un allineamento tipico dopo la pulizia delle sequenze di scarsa qualità e la visualizzazione dei polimorfismi di singolo nucleotide. I polimorfismi totali di singolo nucleotide all'interno di una popolazione vengono conteggiati e il numero di polimorfismi di singolo nucleotide presenti in ciascun clone viene annotato.Ad esempio, la linea sottolineata da una barra contiene due mutazioni uniche, mentre altre otto linee contengono una singola mutazione unica. Questi dati vengono utilizzati per compilare una tabella come quella mostrata qui. La tabella illustra la distribuzione ordinata delle linee sequenziate in base al numero di mutazioni.Il confronto statistico di valori ordinati può determinare se una distribuzione è significativamente diversa da un'altra. Per una più facile interpretazione, i dati numerici ottenuti dall'analisi di sequenza e statistica possono essere rappresentati come grafico o istogramma. Come mostrato qui, il virus A 3 72 V genera meno mutazioni rispetto al tipo selvatico e presenta una frequenza di mutazione significativamente inferiore, con un valore P minore di 0,01.La stessa popolazione virale di ganga del pollo produce frequenze di mutazione simili, indipendentemente dal fatto che per l'estrazione dell'RNA venga utilizzato il ceppo virale o una diluizione 10 alla quinta. Pertanto, seguendo questo procedimento, si potrebbe desiderare di eseguire saggi biochimici in vitro o studi di cristallizzazione per comprendere meglio le basi meccanistiche e strutturali della fedeltà in questo varianti della polimerasi.Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia per esplorare la correlazione tra diversità genetica e idoneità del virus in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come aumentare le probabilità di isolare varianti di fedeltà di virus a RNA e di come utilizzare le frequenze di mutazione per identificare queste differenze di fedeltà.

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