Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la vasculatura cerebral del ratón adulto en 3D. Esto se logra abriendo primero la cavidad torácica y eliminando toda la sangre de la vasculatura a través de la perfusión intraoral de PBS Con heparina después de la perfusión, el agente de yeso se inyecta en el ventrículo izquierdo para perfundir todo el sistema circulatorio. A continuación, se extrae el cerebro perfundido y se fija en aldehído Paraform.

El paso final del procedimiento es deshidratar y clarificar el tejido cerebral con etanol y salicilato de metilo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un cerebro de ratón transparente cuyo árbol vascular se puede visualizar bajo un microscopio de campo claro o de disección, y mediante micro tomografía computarizada. Hola, mi nombre es Spen Walker y estudio de la Universidad de California en San Francisco.

Hoy vamos a hacer un molde vascular del cerebro de un ratón adulto. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes como la angiografía, es que se puede aplicar a animales pequeños como el ratón. No hay necesidad de material radiactivo y es un procedimiento relativamente sencillo de realizar.

Ha aportado adaptación a diversas herramientas analíticas, como el campo claro, el análisis microscópico, la tomografía computarizada, debido a la característica radiopaca del material, así como el análisis histológico e inmunohistoquímico. Bien, comencemos. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina diluida en solución salina y confirmar anestesia completa mediante pellizco de pata.

Una vez que se haya confirmado la anestesia, use unas tijeras para hacer una incisión en el pecho justo debajo de la apófisis xifoides. A continuación, corte a través del diafragma y luego entre el segmento dorsal y ventral de la caja torácica. Para exponer la cavidad torácica, pliegue el esternón y la pared torácica adyacente y asegúrelos con un hemostático para exponer el saco pericárdico.

A continuación, abra el saco pericárdico con pinzas si es necesario para exponer el corazón Con la bomba de perfusión ajustada a 100 milímetros de mercurio, comience a perfundir PBS más cinco unidades por mililitro de heparina tibia a 37 grados centígrados. Inserte la aguja roma de calibre 22 conectada al flujo de salida de la bomba en el ventrículo izquierdo, cerca del ápice del corazón. Cortar inmediatamente.

Abra la aurícula derecha para permitir la salida sistémica de la sangre y continúe lavando hasta que la sangre se elimine de la circulación. Primero, haga una solución de agente de fundición mezclando cinco mililitros del diluyente con cuatro mililitros del compuesto filtrado. A continuación, agregue 450 microlitros del agente de curado y asegúrese de usar la solución de agente de fundición dentro de los 20 minutos.

Mezcle la solución de agente de fundición directamente antes de usar. Para garantizar la viscosidad adecuada, extraiga la solución del agente de fundición en una jeringa de 10 mililitros. Coloque una aguja roma de calibre 20 en la jeringa y llene la aguja con la solución.

Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo a través del mismo orificio que se usa para enjuagar la sangre y luego asegure la aguja en su lugar Con una pinza de hemostático, inyecte lentamente la solución de agente de yeso manualmente en el ventrículo izquierdo a aproximadamente tres mililitros por minuto, ya que el exceso de presión puede provocar un flujo incorrecto o una posible ruptura del vaso durante la inyección. Busque signos de perfusión exitosa, incluida la visualización del agente de yeso en la vasculatura intestinal y hepática, decoloración distal de las extremidades y decoloración de la nariz y la lengua. Vuelva a ajustar la aguja si es necesario para lograr una perfusión adecuada.

Retire el cerebro y colóquelo en aldehído paraformado al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, deshidrate el cerebro en el transcurso de siete días colocando el cerebro directamente en etanol cada vez más concentrado a temperatura ambiente a partir del primer día con etanol al 25%. Una vez que el cerebro está deshidratado, clarifique el tejido cerebral alrededor de los vasos sanguíneos sumergiendo el cerebro perfundido en salicilato de metilo durante dos días a temperatura ambiente. Después de dos días, la vasculatura de todo el cerebro clarificado se puede visualizar sin seccionar por inmersión en salicilato de metilo bajo un microscopio de campo brillante, así como un microscopio de disección o una micro tomografía computarizada utilizando microscopía de campo claro, La vasculatura se puede ver en diferentes planos focales sin seccionar el cerebro, así como microvasos individuales con mayor aumento.

Se muestra aquí en el panel inferior. Bajo un telescopio de disección, se puede ver toda la estructura vascular cerebral en un plano focal, lo que permite una mejor visualización de su estructura tridimensional. Esta imagen muestra la morfología de los vasos grandes y la vasculatura de todo el cerebro, pero carece de los detalles que se muestran en las imágenes tomadas con microscopía de campo claro.

La microtomografía computarizada permite la visualización en 3D de la vasculatura y permite la construcción de modelos 3D giratorios. Para visualizar la vasculatura, aquí se muestra una estructura vascular cerebral anormal detectada por micro TC que se correlaciona con una imagen de microscopio de campo claro de la misma malformación vascular. En conjunto, estos datos muestran que la misma muestra se puede analizar utilizando múltiples herramientas de imagen después del yeso vascular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo moldear los vasos sanguíneos del esguince de ratón adulto usando una solución de microrelleno. Este procedimiento incluye la eliminación de la sangre de la vasculatura, la inyección intraventricular del micrófono, la recolección y procesamiento de la solución del cerebro del ratón adulto y la obtención de imágenes de la vasculatura cerebral mediante microscopía de campo claro. El objetivo general de este procedimiento es ver la vasculatura ceal del cerebro del ratón adulto en tres dimensiones.