Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Leukozyten an der Endothelseite in entnommenen Druckgefäßen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Halsschlagader von einer Ratte oder einer Maus isoliert wird. Anschließend wird das Gefäß auf eine Druckkammer montiert.

Das Gefäß wird dann unter Druck gesetzt und eine Stunde lang bei einem gewünschten Druck inkubiert. Zum Schluss wird markiertes Vollblut durch das unter Druck stehende Gefäß perfundiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Echtzeit-Adhäsion von Leukozyten an das Endothel durch eine maßgeschneiderte ex vivo-Gefäßkammer zeigen, die mit einem Edel-, Servo- und einem Fluoreszenzmikroskop gekoppelt ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie statischen Adhäsionsassays besteht darin, dass die Leukozytenadhäsion in intakten funktionsfähigen Arterien mit Vollblut beobachtet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung von Bluthochdruck zu beantworten, wie z. B. die Wirkung eines hohen intraluminalen Drucks auf Entzündungen und wie er zur Atherosklerose beitragen kann. Nach der Isolierung der Halsschlagadern ab einem Alter von 10 Wochen, verteilen Sie Dolly-Ratten und bereiten Sie die Perfusionskammer vor und setzen Sie sie unter Druck, montieren Sie das Gefäß unter einem Präpariermikroskop, indem Sie zuerst schwarze Polyesterbinder auf jede Kanüle legen, bewegen Sie das Gefäß in die Badewanne und montieren Sie dann ein Viertel des Gefäßes auf die P 1-Kanüle.

Achten Sie darauf, dass Sie das Gefäß nicht mit einer mit Krebspuffer gefüllten Spritze zerreißen. Spülen Sie überschüssiges Blut vorsichtig durch den P one Schallkopf aus dem Gefäß. Verschließen Sie P eins zur Kammer.

Befestigen Sie das Gefäß mit dem Polyesterbinder an der Kanüle P one. Kanülen und Kanülenhalter für die Montage auf die Kanüle P zwei näher rücken. Montieren Sie das distale Viertelende des Gefäßes auf die Kanüle P two.

Befestigen Sie es mit einem Polyesterbinder, um das Gefäß unter Druck zu setzen. Stellen Sie die Kanülenhalter so ein, dass das Gefäß nicht verbiegt oder gedehnt wird, wenn P eins und P zwei zur Kammer geschlossen sind. Schalten Sie das Druckservo von automatisch auf manuell um.

Überprüfen Sie das Druckservo, um sicherzustellen, dass innerhalb von 10 Sekunden kein Druckabfall auftritt. Ein Druckabfall deutet also darauf hin, dass ein Leck vorliegt, und die Anschlüsse und der Messumformer müssen an Ort und Stelle befestigt werden, um sicherzustellen, dass sie druckdicht sind. Stellen Sie das Druckservo wieder auf Automatik, öffnen Sie dann P zwei zur Kammer unter dem Mikroskop und beobachten Sie, wie sich das Gefäß erweitert.

Wenn der Hahn zur Kammer hin geöffnet ist. Schalten Sie das Druckservo auf manuell. Überprüfen Sie erneut, ob der Druck abnimmt.

Wenn der Druckabfall anhält, ist das System nicht druckdicht und es ist wahrscheinlich, dass sich ein Loch im Behälter befindet. Schalten Sie wieder auf Automatik und öffnen Sie P eins zur Kammer. Prüfen Sie bei der manuellen Einstellung, ob der Druck stabil bleibt.

Wenn es stabil ist, erhöhen Sie die Skala auf zwei, wodurch das Gefäß auf 40 Millimeter Quecksilbersäule unter Druck gesetzt wird. Schalten Sie auf Automatik um und beobachten Sie das Gefäß unter dem Mikroskop. Stellen Sie bei Bedarf den Kanülenhalter so ein, dass das Gefäß bei der manuellen Einstellung nicht verbiegt.

Überprüfen Sie die Lecks. Erhöhen Sie dann die Einstellstufen von eins auf Automatik dazwischen, um das Gefäß unter dem Mikroskop zu beobachten, bis der gewünschte Druck erreicht ist. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, bewegen Sie die Kammer zum Stereomikroskop.

Schließen Sie den auf 37 Grad Celsius eingestellten Temperaturregler an. Schließen Sie dann die Schlauchpumpe und den Aspirator an, um den Krebspuffer im Bad frisch zu halten. Inkubieren Sie das Druckgefäß eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Regelmäßig auf Undichtigkeiten prüfen. Etikettieren Sie 7,5 Milliliter Preco, gesammeltes Vollblut mit leuchtendem Farbstoff im Dunkeln. Dann 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Sammeln Sie das Blut in einer Spritze, reinigen Sie alle Blasen und befestigen Sie es an einer Spritzenpumpe mit einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wärmemantel. Verschließen Sie den Schallkopf P one mit der Kammer und schließen Sie die Spritze und den Abfallschlauch an. Spülen Sie das Blut mit 1000 Mikrolitern pro Minute durch den Abfallschlauch, um alle Luftblasen zu entfernen, die P eins zur Kammer öffnen.

Das Druckservo passt sich automatisch an, um den gewünschten Druck aufrechtzuerhalten, perfundiert das Blut mit 100 Mikrolitern pro Minute mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Digitalkamera gekoppelt ist, und zeichnet zwei Felder des perfundierten Gefäßes 15 Sekunden lang zu verschiedenen Zeitpunkten auf. Hier sind repräsentative Bilder von Leukozyten zu sehen, bei denen Leukozyten als Adhärent am Endothel gelten, wenn sie 10 Sekunden lang stationär bleiben. Mit Videoaufzeichnungen in einer Endlosschleife können die Zellen als Durchschnitt pro Feld gezählt werden, während sowohl niedriger als auch hoher Druck ein gewisses Maß an Adhäsion verursachen.

Es wird ein signifikanter Anstieg des Leukozyten-Aions bei höherem intraluminalen Druck beobachtet. Dies wird quantitativ in dieser Grafik gezeigt, in der eine größere Anzahl von Zellen pro Feld bei einem Druck von 120 im Vergleich zu 80 Millimetern Quecksilbersäule haftet. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie PCR und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Gen- und Proteinexpression von Adhäsionsmolekülen zu beantworten.