Одноместный Читайте и парные Конец мРНК-Seq Illumina библиотек из 10 нанограмм Всего РНК

Общая цель этой процедуры заключается в создании библиотек последовательностей мРНК Illumina из небольшого количества исходного материала. Первым шагом процедуры является обратная транскрибация общей РНК с помощью семи праймеров DTT для получения CD NA. cd NA используется для амплификации РНК путем транскрипции in vitro. Впоследствии амплифицированная РНК подвергается случайной фрагментации.

При обратной транскрипции фрагментированной РНК образуется CD NA, которая подвергается отбору размера адаптерного лигирования и амплификации ПЦР. В конечном счете, этот протокол показывает профиль экспрессии генов образца путем измерения количества копий генов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что для нее требуется всего 10 нанограммов начальной общей РНК.

Это на порядки меньше, чем требуется от других существующих протоколов. Более того, он может генерировать пары в библиотеках из таких малых начальных количеств РНК. Этот метод позволит ученым исследовать новые вопросы в биологии, позволяя определять профили экспрессии генов из труднодоступных клеточных популяций, таких как полученные с помощью лазерного захвата, микродиссекции или проточной цитометрии.

Впервые у нас появилась идея разработки этого метода, когда нам нужно было профилировать экспрессию генов из очень ограниченного числа клеток, дифференцированных от амнионных стволовых клеток человека. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы работы с РНК сложны для изучения из-за очень небольшого количества РНК, которое может быть легко разложено. Демонстрировать процедуру будут Анджела Элвелл, Дженнифер Болен и Баал Кимм Винн из моей лаборатории.

Метод параллельной подготовки библиотек одиночного чтения и парной последовательности концов представляет собой многоступенчатую процедуру, как показано на данной блок-схеме. Во-первых, общую РНК выделяют из представляющих интерес клеток или тканей и используют для получения двухцепочечных CD NA полиаденилированных матричных РНК, а затем селективно амплифицируют из CD NA с использованием метода линейной амплификации ewin на основе T seven. Затем амплицированный поли a A случайным образом фрагментируется.

После того, как фрагментированная РНК очищена, она реверсивно транскрибируется в CD NA. CD NA восстанавливается и к трем основным концам фрагментов ДНК добавляются основания. После этого ДНК лигируется адаптером и не проводится ни одно переваривание. В случае одиночной библиотеки Рида библиотеку ДНК затем выделяют путем очистки гелем и амплифицируют с помощью ПЦР для лигирования адаптеров Illumina.

Наконец, после количественной оценки библиотеки ДНК она готова к секвенированию. Для целей этого видео будут продемонстрированы только отдельные процедуры в рамках этого протокола. Обратная транскрипция фрагментированных мРНК полиА в кДНК включает синтез первой и второй цепей.

Для синтеза первой цепи для библиотеки одиночного чтения добавьте следующие реагенты в пробирку для ПЦР, 10 микролитров фрагментированной поли-мРНК и один микролитр не одного случайного нонамерного праймера. Здесь показана последовательность не одного нонамера праймера. Пять простых проксимальных последовательностей, показанных зеленым цветом, не являются одним сайтом рестрикции.

В то время как последовательность, показанная синим цветом, является обратной комплементарной последовательностью адаптера Illumina, последовательность B из набора последовательности чипов инкубирует смесь при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут в термоамплификаторе, а затем быстро охлаждает на льду. Держа смесь на льду, добавьте эти реагенты из верхнего индекса три набора четыре микролитра пяти x первый цепочечный буфер, два микролитра DTT и 1,5 микролитра смеси DNTP В смесь DNTP используйте пять метиловых DCTP вместо DCTP. Поместите пробирку в амплификатор при температуре 42 градуса Цельсия на две минуты, а затем добавьте один микролитр надстрочного индекса три, обратную транскриптазу и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия в течение одного часа.

Затем настройте реакцию для синтеза первой цепи для библиотеки para end. Добавьте в пробирку для ПЦР следующие реагенты, 10 микролитров фрагментированного поли-NNA и один микролитр праймера случайного гексамера. Инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут в амплификаторе, а затем быстро охладите на льду.

Держа пробирку на льду, добавьте следующие реагенты из верхнего индекса три набора первой цепи: четыре микролитра пяти x первая цепь буфера, два микролитра DTT и 1,5 литра DN NTP. Инкубируйте в амплификаторе при температуре 45 градусов Цельсия в течение одной минуты. Затем добавьте один микролитр надстрочного индекса три, обратную транскриптазу и инкубируйте при температуре 45 градусов Цельсия в течение одного часа через час.

Обе реакции готовы к синтезу второй цепи. Добавьте в каждую из смесей на льду, эти реактивы из надстрочного набора по 91 микролитр свободной воды, 30 микролитров по пять х секунд буфера. Три микролитра DN NTP, один микролитр кишечной палочки, ДНК лигазы, четыре микролитра кишечной палочки, ДНК-полимеразы и один микролитр кишечной палочки R nase H. Смешайте каждую пробирку путем инверсии, затем коротко открутите и инкубируйте при температуре 16 градусов Цельсия в течение двух часов.

Для конечной репарации CDNA для библиотеки одиночного чтения добавьте к 40 микролитрам очищенной CD NA следующие реагенты, пять микролитров буфера Т-4 ДНК-лигазы с 10 миллимолярами. A TP два микролитра DNTP Смешайте один микролитр Т-4 ДНК-полимеразы, один микролитр фермента клино и один микролитр Т-четырех PNK для торцевой репарации CD NA Для парной библиотеки концов добавьте к 30 микролитрам очищенной CD NA, эти реагенты 45 микролитров РНК. D NS свободная вода.

10 микролитров буфера Т-4 ДНК-лигазы с 10 миллимолярами. А ТП четыре микролитра по 10 миллимоляров. Смешайте пять микролитров Т-4 ДНК-полимеразы, один микролитр фермента клино и пять микролитров Т-4 ПНК, инкубируйте обе пробирки в термоамплитере при температуре 20 градусов Цельсия в течение 30 минут после окончания ремонта.

Следующим шагом в этом протоколе является добавление адениновых оснований к трем основным концам фрагментов ДНК для библиотеки одного чтения. Приготовьте следующую реакционную смесь: 34 микролитра ДНК образца: пять микролитров буфера клино, 10 микролитров DATP и один микролитр клино экзо. Для библиотеки парных концов приготовьте следующую реакционную смесь: 32 микролитра образца ДНК и пять микролитров буфера clin out.

10 микролитров DATP и три микролитра clin out exo инкубируют обе реакционные смеси при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут перед началом реакции для лигирования адаптера. Разморозьте адаптеры на льду и разбавьте их один к 20 для библиотеки одного чтения. Используйте набор для подготовки образцов последовательности чипов Illumina для приготовления следующей реакционной смеси: 10 микролитров образца ДНК, один микролитр смеси адаптерного олиго, 15 микролитров двух буферов XДНК-лигазы и четыре микролитра ДНК-лигазы инкубировать в течение 15 минут.

При комнатной температуре для библиотеки спаренных концов используйте набор для подготовки образца парного конца Illumina для подготовки следующей реакции. Смешайте 10 микролитров образца ДНК, 10 микролитров полиэтиленового адаптера, смешайте олиго, 25 микролитров двух буферов XДНК-лигазы и пять микролитров ДНК-лигазы, инкубируйте в течение 15 минут при температуре 20 градусов Цельсия в конце соответствующей инкубации. Очистите обе реакции лигирования с помощью колонок XMO.

Elute, библиотека с одним чтением и 44 микролитрами воды, разбавляют парную концевую библиотеку шестью микролитрами буфера иллюзии, за которыми следует еще одна иллюзия в пяти микролитрах eb. Выполнение не одного дайджеста только для библиотеки одного чтения. Инкубируйте в течение двух часов до ночи при температуре 37 градусов Цельсия после очистки реакции с помощью колонки ZY IMO.

Разбавьте библиотеку за одно чтение шестью микролитрами буфера eb, а затем второе разбавление пятью микролитрами eb. Адаптер лигирован, ДНК для обеих библиотек теперь готовы к выбору размера. Процедура выбора размера для лигированной ДНК адаптера выполняется с использованием 2% кибербезопасной ЭЭ из in Vitrogen, чтобы начать эту процедуру с нулевым предварительным запуском программы в течение двух минут.

После предварительного прогона загрузите 10 микролитров одного KB плюс лесенка и образцы 2D NA. Заполните пустые дорожки 10 микролитрами программы пробега воды. Один эгель 2%бегать в течение 28 минут.

Когда тираж достигнет своего размера, выберите от 200 до 300 базовых пар гелевых ломтиков с помощью свежего лезвия бритвы. Было оценено количество генов, идентифицированных различными библиотеками, и в этой таблице представлена информация о номерах кластеров. Гены определили частоту ошибок и процент выравнивания библиотек одиночного чтения и парных концов как для одиночного чтения, так и для парных конечных библиотек.

10-нанограммовые библиотеки T seven LA идентифицировали почти такое же количество генов, как и 10-микрограммовые библиотеки UN с TPM 10 или более. В случае библиотек с одним чтением, 10-нанограммовая библиотека T seven LA идентифицировала 100% из 8 500 генов, идентифицированных 10-микрограммовой амплифицированной библиотекой UN для парадигмальных библиотек. Библиотека T seven LA размером 10 нанограмм идентифицировала 86% генов, идентифицированных библиотекой 10 микрограммов.

Библиотеки, сделанные из менее чем 10 нанограммов, не смогли идентифицировать столько генов. Например, в протоколе одиночного чтения библиотека T seven LA с точностью до 1 нанограмма идентифицировала только около 50% генов, идентифицированных библиотекой с молекулярной амперой в 10 микрограммов. Таким образом, наименьшее количество общей РНК для использования с протоколом T 7 LA должно быть ограничено 10 нанограммами картирования гена

GA DH показывает, что все библиотеки T seven LA, созданные с не менее чем 10 нанограммами стартовой РНК, идентифицировали все экзоны, включая крайний пять простых экзонов. Масштабная линейка слева для библиотек с одним чтением показывает 350 операций чтения. Масштабная линейка в центре библиотек DEN показывает 5 000 операций чтения.

Сравнение 10-нанограммовых библиотек T seven LA для одиночного чтения и спаренного конца с библиотеками min amp показывает высокую степень сходства. Корреляция Спирмена 0,90 была получена между библиотекой T seven LA с одиночным чтением 10 нг и библиотекой мин 10 мкг, а корреляция 0,95 была получена между библиотекой PEREN 10 нг T seven LA и библиотекой мин ампер 10 мкг. Кроме того, было проведено сравнение между двумя библиотеками для одиночного чтения и peren, изготовленными из общей РНК объемом 10 нанограммов, и очень высокий коэффициент корреляции демонстрирует, что оба типа библиотек, изготовленных с использованием протокола T seven LA, производят очень похожую сигнатуру экспрессии генов.

Наконец, поскольку эти библиотеки были получены из 30 стволовых клеток эмбриональных стволовых клеток человека, в библиотеках проводился поиск специфических генов. Почти все эти гены были идентифицированы библиотеками, изготовленными по крайней мере из 10 нанограммов начальной общей РНК, что подтверждает этот протокол. При выполнении этого протокола важно помнить о том, что с небольшими образцами РНК следует обращаться с особой осторожностью, чтобы предотвратить деградацию.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее представление о том, как подготовить библиотеки Illumina, Mr.Aeq для одиночного чтения и Paradigm из очень небольшого количества исходного материала.