Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении очень чистых рекомбинантных белков с помощью двухступенчатой процедуры аффинной очистки. Для достижения этой цели биспецифическую очищающую метку, основанную на альбуминсвязывающем домене, клонируют в экспрессирующий вектор, содержащий интересующий ген, с последующей экспрессией гибридного белка в кишечной палочке. В качестве второго этапа бактериальный лизат, содержащий целевой белок, подвергают очистке на хроматографической колонке иммобилизованным сывороточным альбумином человека или HSA.

Затем следует дополнительная очистка на колонке MAB select superior resistance или sure column, содержащей иммобилизованный Z-домен, полученный из стафилококкового белка A. В результате получается высокочистый продукт, пригодный для применения в сложных условиях. Затем чистоту оценивают с помощью SDS и, при необходимости, масс-спектрометрии, чтобы убедиться, что интересующий белок был успешно очищен до гомогенности, результаты показывают эффективную очистку после двух последовательных этапов по сравнению с одним этапом с помощью новой биспецифической метки очистки, используемой в этом протоколе. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как одноступенчатая аффинная очистка, заключается в том, что чистый белок может быть достигнут с помощью простого протокола, использующего только один аффинный дескриптор, независимо от свойств или целевого белка.

Этот метод может быть использован для белка с очень разнообразными характеристиками. Кроме того, поскольку метка очень маленькая, она легко вырабатывается бактерией-хозяином. Как правило, люди, не знакомые с этой процедурой очищения, найдут ее очень простой и понятной.

Критически важным шагом является регулировка pH образца перед его загрузкой во вторую колонку. Малая очищающая метка с двумя присущими ей аффинностями была разработана путем включения дополнительного сайта связывания в существующий домен связывания альбумина, полученный из стрептококкового белка G. 46 аминокислотных альбуминсвязывающих доменов сворачивается в стабильный пучок из трех спиралей и содержит сайт связывания для сывороточного альбумина человека, в первую очередь расположенный на второй спирали, путем генетической рандомизации 11 поверхностно экспонированных аминокислот, расположенных в первой и третьей спирали. сконструировал несколько раундов биопсового панорамирования против диаметральной зомы, полученной из стафилококкового белка А с комбинаторной библиотекой, экспрессированной на фаге, в результате чего была получена биспецифическая молекула, названная A BDZ, с аффинностью как к HSA, так и к Z-домену. Для получения плазмиды экспрессии биспецифической фьюжн-метки готовят ПЦР-фрагменты гена A BDZ one, фланкированные подходящими сайтами рестрикции для ирования и терминально от гена-мишени в расщеплении экспрессии плазмиды, фрагменты ПЦР A BDZ one и очищенный экспрессирующий вектор, содержащий интересующий ген

Затем лигируют ограниченный фрагмент A BDZ one в экспрессирующий вектор, содержащий интересующий ген, и трансформируют продукт лигирования в кишечную палочку. Распределите трансформированные клетки на сельскохозяйственных планшетах, дополненных подходящими антибиотиками для селекции. ПЦР-скрининг нескольких колоний и секвенирование проверяют полученную экспрессию в кассете с помощью секвенирования ДНК.

Наконец, готовят плазмиду из ночной культуры колонии, проверенной на последовательность, и трансформируют в предпочтительный экспрессирующий штамм для экспрессии целевого белка. После того, как новая метка была слита до конца, Термини сначала инокулировал одну бактериальную колонию в 10 миллилитров соевого бульона триптиха, с добавлением пяти граммов на литр дрожжевого экстракта и соответствующих антибиотиков, инкубировал при 150 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день внесите один миллилитр ночной культуры в 100 миллилитров свежего, среднего и индуцируйте экспрессию белка.

Когда клетки достигают логарифмической фазы роста. После индукции белка инкубируйте клетки при 150 оборотах в минуту и 25 градусах Цельсия в течение ночи, соберите клетки на следующий день путем центрифугирования с помощью центрифугирования ортогонального аффинного белка A BDZ one Fusion достигается путем первоначальной очистки либо на колонке с иммобилизованным HSA, либо на зоме. Затем проводят последовательную стадию очистки с использованием второго сродства биспецифической метки.

Хроматографические среды с иммобилизованным Z-доменом, такие как MA select sure, легко доступны для очистки антител. В то время как HSA может быть химически связан со средой для получения второй матрицы для продолжения ортогональной аффинной очистки Resus, суспендируя гранулу в 25 миллилитрах проточного буфера. Затем нарушьте работу клеток с помощью ультразвуковой обработки с амплитудой 60% и импульсами в одну секунду, после чего следует пауза в одну секунду в общей сложности на три минуты.

После центрифугирования образца перед дальнейшей очисткой отфильтруйте целевой белок, содержащий супернатин, через фильтр 0,45 мкм. Затем уравновесьте одномиллилитровую колонку HSA spheros или колонку, активированную NHS, в сочетании с HSA с 10 объемами рабочего буфера в колонке со скоростью один миллилитр в минуту на подходящей системе очистки белка. После уравновешивания загрузите бактериальный лизат со скоростью 0,5 миллилитра в минуту, сбросьте скорость потока до одного миллилитра в минуту и промойте колонку пятью объемами промывочного буфера, а затем пятью объемами промывочного буфера.

Разбавьте образец элюирующим буфером со скоростью один миллилитр в минуту и соберите фракции. Контролируйте поглощение на 280 нанометрах для выбора фракций из неуловимого пика. Для дальнейшей очистки объедините фракции с самой высокой концентрацией белка, затем разбавьте в два раза.

Убедитесь, что буфер работает и уровень pH находится на нейтральном уровне. Этот этап имеет решающее значение для связывания белка с Z-доменом. Добавьте один моляр tris HCL pH eight для увеличения pH при необходимости.

Затем загрузите образец со скоростью 0,5 миллилитра в минуту на MA с высоким содержанием в один миллилитр, выберите столбец sure, который был уравновешен с sure . Работающий буфер после сброса расхода до одного миллилитра в минуту, колонна промывается пятью объемами колонны надежного рабочего буфера. Затем элюируйте белки 0,2 молярной уксусной кислотой pH 2,7 для чувствительных целевых белков.

ЭИТ может быть нейтрализована непосредственно при сборе путем добавления T-триса. Страница H-C-L-S-D-S может быть использована для оценки чистоты белка. Важно полностью уменьшить пробу, так как свободный цит в BDZ может вызвать димеризацию продукта в невосстановительных условиях.

В качестве заключительного этапа молекулярная масса очищенного продукта может быть проанализирована с помощью масс-спектрометрии после очистки по ортогональному протоколу на колонке HSA, за которой следует колонка с выбором MA. Различные образцы, собранные в нескольких точках очистки, были проанализированы на странице SDS. Образцы включали в себя саму метку A BDZ one, а также три различных человеческих белка-мишени, слитых с AB DZ one, представляющих различные классы растворимости, молекулярные массы и изоэлектрические точки.

Полосы с первой по четвертую показывают лизаты белка перед очисткой для трех различных белков AB DZ одного, слитого белка и самой метки AB DZ one. Полосы с пятого по восьмой показывают результаты этапа очистки белков HSA. Наконец, полосы с 9 по 12 являются результатом последнего этапа очистки mAbs Sure.

Кроме того, здесь анализировались образцы, полученные из тех же лизатов, очищенных в обратном порядке на тех же колонках. Полосы с первой по третью показывают лизаты до очистки, тогда как полосы с четвертой по шестую были взяты после первого этапа очистки в столбце MAB Select Sure. Продукты высокой чистоты на дорожках с седьмого по девятый являются результатом окончательной очистки HSA.

Результаты ясно показывают полезность двойной метки и двух высокоспецифичных этапов очистки. Несмотря на то, что после начальной стадии очистки достигается достаточная чистота, как это видно по гелям, на следующей стадии получается очень чистый продукт, хорошо подходящий для применения в очень сложных условиях. После освоения этап очистки, центральный для этого метода, может быть выполнен за несколько часов одним человеком для получения высокочистого рекомбинантного белка, пригодного для многих различных применений.

Например, следуя этой процедуре, очищенные биомолекулы могут быть использованы для других целей, таких как исследования взаимодействия, чтобы ответить на такие вопросы, как прочность связывания комплекса. После просмотра этого видео у вас должно быть действительно хорошее понимание того, как получить настоящий чистый белковый продукт, используя эту двойную аффинити-метку.