Réponses d'imagerie neuronale dans les préparations d'organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

L’objectif général de cette procédure est d’illustrer comment préparer des coupes de tissus vivants pour l’imagerie des réponses aux phéromones dans les neurones des organes nasaux MRO. Ceci est accompli en préparant d’abord des coupes d’organe nasal MRO ou de tissu VNO vivant à partir de souris exprimant un indicateur de calcium génétique GCaMP deux. L’étape suivante consiste à installer le système de perfusion sur la platine du microscope pour maintenir la tranche, appliquer un stimulus et imager.

La réponse. Une expérience d’imagerie en accéléré est ensuite réalisée avec divers stimuli de phéromones, suivie d’une analyse des données des résultats d’imagerie. En fin de compte, des modèles de réponse des neurones VNO à différents stimuli de phéromones sont obtenus.

Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes comme la charge de calcium D ou l’imagerie dans les cellules dissociées est que nous pouvons préserver la morphologie intacte des cellules, mieux maintenir la santé des coupes et obtenir un signal plus fort. Cette méthode peut nous aider à répondre à certaines des questions clés dans les études du système nasal chaud, telles que l’identification des ligands et de leurs récepteurs et le profilage des réponses individuelles des neurones nasaux du ver. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le psoriasis olfactif, sérique ou cérébral.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés en raison de la difficulté d’obtenir un bon psoriasis et de mettre en place le système de profusion. Avant de commencer cette procédure, préparez les solutions requises, y compris la souris, la solution de sonnerie de liquide céphalo-rachidien artificiel, 4 % d’aros à faible fusion et les stimuli de phéromones selon le manuscrit ci-joint. Ensuite, placez deux tubes d’aros à bas point de fusion sur un bloc de chaleur.

Réglez la température à plus de 60 degrés Celsius pour faire fondre les aros. Une fois le gel liquéfié, transférez les tubes dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius. Pour préparer les tranches VNO.

Après avoir décapité une souris GCaMP euthanasiée, coupez les os de la mandibule avec une paire de ciseaux pour retirer la mâchoire inférieure. Ensuite, décollez le tissu strié du palais supérieur pour exposer la cavité nasale. Séparez ensuite les os de la mâchoire en insérant une lame chirurgicale entre les deux incisives avant.

Retirez délicatement l’os de la mâchoire pour exposer le VNO. À ce stade, soulevez tout le VNO de la cavité nasale en le tenant sur le coccyx. Transférez le VNO à la souris froide oxygénée, une solution de LCR.

Immédiatement sous l’endoscope de dissection, séparez les deux vno en faisant glisser doucement les pointes de la pince le long de la paroi de l’os septal. Retirez l’os vulner qui enveloppe le tissu VNO. Ensuite, soulevez doucement tout le tissu VI NO de la cavité osseuse.

Des précautions extrêmes doivent être prises dans cette étape pour éviter d’endommager le neuroépithélium. Ensuite, retirez complètement les petits fragments d’os laissés à la surface du tissu. Avant l’encastrement, fragments laissés sur.

Le tissu peut être attrapé par la lame de coupe qui tirerait le tissu hors du bloc aros. Après cela, utilisez la pince pour tenir l’extrémité postérieure du tissu VNO et immergez-le doucement dans l’aros fondu. Refroidissez rapidement le tube sur de la glace.

Pour solidifier les aros, le processus d’enrobage et de refroidissement doit prendre moins de deux minutes. Coupez ensuite le bloc aros contenant le VNO et collez-le sur le porte-mouchoir. Ensuite, insérez le porte-mouchoir dans le cylindre métallique et remplissez la chambre restante avec des aros supplémentaires à faible point de fusion.

Une fois que l’aros à faible fusion se solidifie sur la glace, procédez immédiatement à la sectionnement, injectez immédiatement un LCR de souris A oxygéné froid dans la chambre de sectionnement de la trancheuse à tissus et coupez les tranches de 180 à 200 microns d’épaisseur chacune. Ensuite, récupérez et transférez les tranches de section dans la chambre d’incubation. Les tranches sont viables pendant six à huit heures dans le LCR oxygéné de souris A à température ambiante.

Dans cette procédure, placez d’abord une tranche de VNO au milieu de la chambre de perfusion et maintenez la tranche vers le bas avec une ancre de tranche. Les fils de l’ancrage ne doivent appuyer que contre la partie à faible fusion de la tranche, mais pas contre le tissu VNO. Ensuite, délivrez le LCR de souris A oxygéné dans la chambre de perfusion par l’orifice d’entrée à environ 100 microlitres par seconde.

Le liquide est drainé à travers une aiguille d’aspiration via l’orifice de sortie pour fournir un flux continu de LCR A de souris frais. Ensuite, remplissez une seringue de 30 millilitres avec une solution de sonnerie et fixez-la à la pompe à seringue. Réglez la vitesse de la pompe sur 300 à 600 microlitres par minute.

Pour fournir un flux continu de solution de sonnerie sur la tranche, connectez la sortie des sonneries à la boucle d’injection A-H-P-L-C. La commande de boucle d’injection comporte deux voies d’écoulement. En position de chargement, chargez l’échantillon d’urine de souris dans la boucle d’échantillonnage à l’aide d’une seringue de précision Hamilton.

L’échantillon excédentaire sort de la boucle d’échantillonnage par la sortie des déchets. La solution de Ringer injectée par le pousse-seringue contourne la boucle d’échantillonnage et va directement à la sortie, qui est reliée à l’embout de perfusion en position d’injection. La solution de pompe s’écoule à travers la boucle d’échantillonnage et pousse les stimuli de phéromones dans la sortie.

Avant l’expérience d’imagerie. Retirez les bulles d’air pour assurer un écoulement régulier du liquide de perfusion. Ajustez ensuite l’embout de perfusion sous une lentille cinq x ou 10 x de sorte que l’embout soit à environ un millimètre de la tranche en O.

Pour mesurer le temps de retard de l’échantillon et la durée avec une charge de colorant fluorescent de 0,1 % rho, dominez six colorants G dans la boucle d’échantillon. Mettez ensuite la vanne en position d’injection. Cinq secondes après le début de l’acquisition de l’image, détectez le signal fluorescent entre 10 et 30 secondes.

La courbe lisse du signal fluorescent indique également qu’il y a peu de turbulence générée sous la lentille plongeante et qu’une perfusion adéquate de souris oxygénée Un LCR atteint la tranche dans notre laboratoire. Le microscope Zeiss Axio scope FS two avec une lentille d’immersion dans l’eau 10 x ou 20 x est utilisé pour l’imagerie time-lapse afin de détecter les signaux GAMP deux. Le filtre passe-bande GFP standard de 450 à 490 nanomètres est utilisé.

Les images épifluorescentes sont acquises par une caméra CCD avec une rotation un par un ou deux par deux en fonction des niveaux d’expression de GCaMP deux. Tout d’abord, réglez la vitesse d’acquisition sur une image par seconde. Ajustez l’intensité de la lumière pour minimiser le blanchiment des deux signaux GCaMP et les dommages causés par la photo aux cellules.

Ensuite, mettez la vanne en position d’injection à un moment précis afin d’obtenir des délais cohérents dans tous les essais dans le cadre d’un ensemble d’expériences. Maintenant, effectuez un test en utilisant la solution de Ringer comme stimulus réajustez la configuration de perfusion si un artefact de mouvement est introduit pendant l’injection de l’échantillon. Après cela, effectuez un test de contrôle positif avec l’urine de souris diluée à un à 100 dans une solution pour éviter la contamination croisée entre différents échantillons.

Lavez la seringue Hamilton avec une solution de sonnerie au moins trois fois après avoir chargé un stimulus. De même, lavez la boucle d’échantillon avec la solution de Ringer au moins trois fois entre différents stimuli avant de l’appliquer. Le stimulus suivant attend quatre à 10 minutes pour que les neurones sensoriels nasaux MRO se rétablissent pour effectuer le recalage d’images de toutes les images acquises à partir d’une tranche.

Un script VBA écrit sur mesure dans Avision est utilisé pour automatiser ce processus. Dans ce cas, toutes les images de la même expérience sont enregistrées par rapport à une image de référence choisie en commun avec un élastique pour effectuer une soustraction d’image afin d’identifier les cellules répondantes. Les macros écrites sur mesure dans l’image J version 1.42 sont utilisées pour automatiser ce processus.

Une image de projection minimale est générée pour chaque pile et les cellules répondantes émergent après que la projection minimale a été soustraite des piles brutes. Ensuite, identifiez la région d’intérêt à partir des piles soustraites et obtenez les coordonnées ROI à l’aide du plugin multi-mesures de l’Image J.Ensuite, traitez toutes les piles pour une expérience et enregistrez toutes les coordonnées ROI dans une liste maîtresse ROI. Après cela, utilisez la liste principale ROI pour mesurer les réponses des cellules à partir des piles d’images brutes avec une macro écrite personnalisée et un plugin multi mesure à partir de l’image J. Tracez ensuite les courbes de réponse et la carte thermique dans matlab.

Voici un exemple de l’expérience d’imagerie VNO utilisant les échantillons d’urine prélevés sur quatre souris individuelles. Environ 80 cellules montrent une réponse à au moins un des stimuli urinaires et leur réponse delta F divisé par les valeurs F sont tracées dans la carte thermique. Voici les traces de réponse des cellules un, deux et trois, qui montrent l’activation du cours du temps par les stimuli urinaires La cellule un affiche la réponse aux deux échantillons d’urine féminins, mais pas aux échantillons masculins.

Alors que la cellule deux montre des schémas d’activation opposés et répond aux deux échantillons masculins. Seule la cellule trois est activée par des échantillons individuels masculins et féminins. Une fois mât, la tranche peut être préparée en 30 minutes et les neurones du piano peuvent être maintenus en vie pendant six à huit heures si elle est effectuée correctement.

Lors de l’essai de cette méthode, il est important de se rappeler d’utiliser des réactifs de qualité culturelle tissulaire et d’éviter les réactifs de fixation tissulaire en contact avec les préparations tissulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer le psoriasis des tissus vivants pour l’imagerie des réponses thermiques dans les neurones de Vienne à l’aide de l’expression de souris G Camp.