השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, לגדל ולנתח שיבוטים של תאי T ספציפיים לאנטיגן HPV ממטופלים. ראשית, קבע קו CD שמונה תאי T, בצע בדיקת SBOT והעריך את התדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן. לאחר בידוד שיבוטי תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן על בסיס הפרשת גמא אינטרפרון, בצע בדיקת סקר אינטרפרון גמא בתפוקה גבוהה כדי לזהות שיבוטים ספציפיים של תאי T לאפיטופ.

המשך לאפיין את שיבוטי תאי ה-T עבור הפפטיד האופטימלי המינימלי. רצפי אפיטופים קובעים גם אם האפיטופ מעובד באופן אנדוגני. לזהות את אלמנט הגבלת ה-HLA ולהעריך תגובתיות צולבת לסוגי HPV אחרים בסיכון גבוה.

בסופו של דבר, המטרה היא לתאר אפיטופים חדשים ורלוונטיים קלינית של תאי T HPV באמצעות סינון ואפיון של תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי T ספציפיים ממטופלים. היתרון העיקרי של טכניקה זו של יציאה משיטות כגון שימוש בבדיקת LY לזיהוי תאי T ספציפיים לאנטיגן הוא שסיכויי ההצלחה גבוהים בהרבה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון אילו חלקים של HPV תאי T מזהים ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של סרטן צוואר הרחם מכיוון שניתן לפתח חיסונים ואימונותרפיה על סמך הידע על הספציפיות של תאי T.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אפיטופים של תאי T CD שמונה וניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון אפיטופים של תאי T CD, בדיקת SPO של אינטרפרון גמא עם קו תאי CD שמונה T שהוקם מנבדק 1, קבעה כי אזור H PV 6 16 E 6 46 עד 70 מכיל אפיטופ של תאי T. תאי T ספציפיים לאפיטופים אלה נבחרו על בסיס הפרשת אינטרפרון גמא. הכן את תערובת תאי ההזנה של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אלוגני מוקרן, להיות תאי לימפובלסטים ופיטו המגלוטינין במדיום תאי E שלם.

כעת, באמצעות דילול סדרתי של תאי ה-T הספציפיים לאפיטופ המבודד בתערובת תאי ההזנה, הכינו ריכוז של חמישה תאים למיליליטר עם צלחת פיפטר רב-ערוצית. 100 מיקרוליטר לבאר של תאי T ספציפיים לאפיטופ מדולל ל-96 צלחות תחתונות עגולות. תרבית במשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 מעוררת תאים עם אינטרלוקין אנושי רקומביננטי 2 ביום 11 עד 14.

זהה חזותית שיבוטים גדלים של תאי T ככדורים גדולים בתחתית בארות הצלחת. לפעמים התקשורת הופכת לצהובה. הכן תערובת תאי הזנה חדשה והשלם ecel, בינוני alquot מיליליטר אחד לבאר של צלחת 24 בארות.

ניסוי מוצלח תלוי ביכולת לבודד ולגדל שיבוטים של תאי T עם מיקרו פיפטר של 200 מיקרוליטר. העבר את שיבוטי תאי ה-T בנפרד לבארות נפרדות של תאי ההזנה הקפלים. חזור על הפעולה עד שכל שיבוטי תאי ה-T יועברו.

מצפים בארות של צלחות סבוט סטריליות עם 50 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. נוגדן חד שבטי ראשוני נגד אינטרפרון גמא לאחר דגירה של שעה בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS.

לאחר מכן חסום קשירה לא ספציפית עם 50 מיקרוליטר של סרום אנושי מאגר של 5% ב-RPMI 1640. פזר תמיד בועות גדולות על ידי פיצוץ עם מחט סטרילית. דגירה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר מכן, הוסף אחת כפול 10 ל-LCL האוטולוגי החמישי ב-50 מיקרוליטר של RPMI 1640 עם סרום אנושי של 5%. המשך לערבב תאים של כל שיבוט תאי T עם פיפטה של מיליליטר אחד ולהעביר מאה מיקרוליטר לצינור עינור סטרילי. יש לדלל עם 500 מיקרוליטר RPMI 1640 המכיל 5% סרום אנושי מאגר.

לאחר מכן תאי גלולה על ידי צנטריפוגה, מרוקנים את הסופרנטנט ומשעים מחדש תאים ב-110 מיקרוליטר של RPMI 1640 המכילים 5% סרום אנושי. כעת צלחת 50 מיקרוליטר מכל תרחיף תא משובט להקרנה מהירה בבארות הממוקמות באופן זהה של שתי לוחות הספוט של אליס עבור בארות הבקרה החיוביות של PHA. שלב את המדיה הנותרת מכמה צינורות עינור וצלחת 50 מיקרוליטר כל אחד לבארות הבאות הממוקמות באופן זהה.

הכינו גם בארות בקרה שליליות עם 50 מיקרוליטר מדיה. כעת עבור לוחית הבדיקה, הוסף 50 מיקרוליטר של פפטידים הכלולים באזור החיובי לבארות הבקרה החיוביות. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PHA ו-40 מיקרוליטר של RPMI 1640 ולצלחת המדיה בלבד.

הוסף 50 מיקרוליטר של RPMI 1640 עם סרום אנושי מאגר של 5% דגירה על לוחות הספוט של אליס בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2. אין להזיז את הצלחות במהלך כל תקופת הדגירה. שפכו מדיה, ואז שטפו בארות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS המכילים 0.05% בין 20.

לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של הנוגדן החד-שבטי המצומד נגד אינטרפרון גמא ודגרו למשך שעתיים. יש לשטוף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS המכיל 0.1% בין 20. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של פרוקסידאז צנון סוסים טרי וקשור ביוטיניל כל אחד דגירה של צלחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך שעה לאחר שלוש כביסות עם PBS המכיל 0.1% טווין 20, הוסף 50 מיקרוליטר יציב.

דינו בנזין מאפשר התפתחות צבע במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כעת יש לשטוף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מים נטולי יונים. הניחו לצלחת להתייבש לחלוטין.

ספרו את הכתמים באמצעות קורא ספוט אוטומטי של אליס. בחר שיבוטים של תאי T לאישור ספציפי לאפיטופ. לאחר מכן בצע את בדיקת הנקודה של אליס עם 10 עד תאי T משובטים שלישיים לתגובתיות לאחד משלושת הפפטידים הכלולים באזור האפיטופ.

הכן LCLs אוטולוגיים הנגועים בנגיף חיסון רקומביננטי מסוג פרא וגם LCLs אוטולוגיים הנגועים בנגיף החיסון הרקומביננטי המבטא את חלבון HPV 16 E שש או E 7. שוב, השתמש במבחן הבוט של אליס על תאי שיבוט T נבחרים כדי להשוות תגובתיות ל-LCLs אוטולוגיים הנגועים בנגיף חיסון רקומביננטי מסוג פרא ותגובתיות ל-LCLs אוטולוגיים הנגועים בנגיף חיסון רקומביננטי, המבטא את חלבון HPV 16 E שש או E שבע עם שיבוטים נבחרים של תאי T. ראשית, בצע בדיקת אליס ספוט באמצעות סדרה של תשעה פפטידים חופפים של MER המכסים את אזור האפיטופ.

לאחר מכן בצע בדיקת LY נקודתית לתגובתיות לסדרה של פפטידים באורך משתנה. המשך לבדיקת נקודת שכיבה עם טווח ריכוז של מעט פפטידים. סביר להניח שיכיל את רצף חומצות האמינו המינימלי והאופטימלי.

הכן LCLs אלוגניים המבודדים מהאדם המעניין החולקים מולקולה אחת או שתיים של HLA Class One. בחר שיבוטי תאי T מתבשלים היטב. בצע בדיקת אלי נקודתית באמצעות 10 עד חמישית מה-LCLs האלוגניים, 10 לתאי השיבוט השלישיים של תאי T, ועם הפפטיד המינימלי והאופטימלי ב-10 מיקרומולר.

לאחר אפיון שיבוטי תאי ה-T הספציפיים לאפיטופ, ניתן לבדוק אותם לתגובתיות צולבת לסוגי HPV אחרים בסיכון גבוה. כל שעליך לעשות הוא לסנן תאי T משובטים מעניינים עם מבחן נקודתי של אלי לתגובתיות עם פפטידים המכילים רצפי חומצות אמינו הומולוגיות מסוגי HPV אחרים בסיכון גבוה. הנבדק הראשון הוא אישה אפרו-אמריקאית בת 22 עם היסטוריה של נגע תוך-אפיתל קשקשי בדרגה גבוהה שאובחן על ידי ביופסיה.

ביום הטיפול בהליך כריתה חשמלית LU, נלקחו תאי T מהמטופל. תוצאות הבדיקה הנקודתית של אליס של קו תאי CD 8 T שלה מצביעות על כך שאזור HPV 16, E 6 46 עד 70 הכיל אפיטופ של תאי T המבוסס על רמות הפרשת גמא אינטרפרון 1.2 כפול 10 עד החמישי. תאי T ספציפיים לאפיטופ נבחרו לאחר הגבלת הדילול בחמישית מהתאים שנבחרו.

262 שיבוטים של תאי T נקטפו. התאים הנותרים שנבחרו לא היו בשימוש מאז שהניסיון הראשון לשיבוט תאי T הצליח. הירו ביצע בדיקת אליס נקודתית שבוצעה על 94 מהשיבוטים הללו זיהה 62 שיבוטים חיוביים למסך.

שיבוטי תאי ה-T הנותרים לא נבדקו מאז שבדיקת אליס ספוט הראשונה זיהתה שיבוטים ספציפיים של תאי T לפפטיד. האופי הספציפי של האפיטופ של שמונה. שיבוטים חיוביים למסך הגדלים אושרו עם שלושת 15 פפטידי MER המכסים את האזור בנפרד.

כל שיבוטי תאי ה-T הצביעו על חיובי עם פפטידים של HPV 16, E 6, 51 עד 65. שישה מתוך שמונה שיבוטים היו חיוביים עם פפטיד E 6 46 עד 60 ואף אחד מהשיבוטים לא היה חיובי. עם הפפטיד E 6, 56 עד 70 המוצג כאן, מבחני אליס נקודתיים עם LCLs אוטולוגיים הנגועים בנגיף חיסון רקומביננטי המבטא HPV 16 E חלבון שישה או חלבון E 7.

תוצאות אלה מדגימות ששיבוטי תאי T מזהים אפיטופ E 6 מעובד אנדוגני, סדרה של תשעה פפטידים חופפים של MER המכסים את אזור H PV 1646 עד 65 הקל על אפיון הרצף המינימלי והאופטימלי של אפיטופ תאי T. התגובה הטובה ביותר הושגה עם אפיטופים חופפים של פפטידים E 6, 53 עד 61 פפטידים שזיהו את הפפטיד E 6, 52 עד 61, 10 MER כרצף המינימלי והאופטימלי באופן העקבי ביותר. מעניין שלפפטיד E 6 53 עד 61 הייתה תגובה חזקה באותה מידה עם שיבוט תאי T.

עקומות תגובת מינון מספר 79 מצביעות על כך שפפטיד E 6, 52 עד 61 שמר על חיוביות הרבה יותר יעילה מאשר פפטיד E 6, 53 עד 61 בריכוזי פפטידים נמוכים יותר. בדוגמה זו, נבדק A שנמצא מזהה רצף מינימלי ואופטימלי של E 6 75 עד 83 נותח להגבלה מולקולת HLA בדרגה אחת של אפיטופ תאי CD שמונה T חיובי גבוה נראה עם LCL המבטא את שלוש מולקולות B 62 ו-CW. בעוד שחיוביות הרקע מוצגת עם LCL המבטא CW שלוש, אזורים מסוימים בגנום HPV נשמרים היטב.

לדוגמה, רצפים הומולוגיים לאזורים HPV 16, E 6 52 עד 61 שזוהו בנבדק 1 היו קיימים ב-13 סוגי HPV אחרים בסיכון גבוה. בהתאם לכך, זיהוי צולב חזק הוכח עבור שמונה מתוך 13 סוגי HPV בסיכון גבוה לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שבעה שבועות מיום לקיחת הדם אם היא מבוצעת כראוי. זכור להשתמש בטכניקה הסטרילית לאורך כל ההליך.

אל תשכח שהשפעות עבודה כל וירוס יכול להיות מסוכן ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ביגוד מגן בעת ביצוע ההליך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין תאי T חדשים.