المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

يوضح هذا الفيديو طريقة يتم فيها استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) للتحكم في نشاط بروتين عند الغشاء البلازمي. ولتحقيق ذلك، يتم إجراء ترانسفكشن مشترك للخلايا ببروتين FRB المثبت على الغشاء والبروتين المستهدف المدمج مع FK BP. ثم يُضاف مشتق راباميسين محاط بقفص ضوئي (photo caged) إلى الوسط.

بعد ذلك، وأثناء التصوير الحي للخلايا، يتم تسليط الضوء فوق البنفسجي (UV) على منطقة محددة من الخلية. يتم شطر الرابط بين الـ rapamycin والـ biotin، مما يؤدي إلى تحرير المزدوج الكيميائي وناتجه الثانوي؛ ثم ينتشر المزدوج المتحرر داخل الخلايا ويحفز عملية التضاعف (dimerization) بين البروتين المستهدف المسمى بـ FKBP وبروتين FRB المثبت في الغشاء البلازمي في المنطقة التي تعرضت للإشعاع. وفي غياب الأشعة فوق البنفسجية، لا يرتبط FKBP بـ FRB، وبالتالي لا يحدث أي تأثير.

يكشف تحليل البيانات عن تجنيد موضعي للغاية للبروتين المدمج بـ FKBP محل الدراسة بناءً على تأثيره الفسيولوجي. وتتمثل ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل النهج الدوائي والجيني، في الجمع بين سرعة الاستجابة، وخصوصية الهدف، والدقة المكانية. وتمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج نقائل السرطان التي تأتي نتيجة لهجرة الخلايا السرطانية.

وبناءً على ذلك، فإن التحكم في نشاط عوامل الهجرة الرئيسية قد يكشف عن آليتها الجزيئية الدقيقة، وهو أمر ضروري لعلاجها والشفاء منها. سيقوم بتقديم هذا الإجراء كريس بول ماير، وهو طالب دراسات عليا، وبوب دي روز، وهو فني من مختبري. ابدأ هذا البروتوكول بخلط المواد التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم: البلازميد، وDNA، وmembrane tethered FRB، وFLUORESCENTLY tagged FKBP، وTIA one، والماء منزوع الأيونات؛ ثم أضف 1 µL من a few gene HD إلى الخليط وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس.

قم بتحضين الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وأثناء التحضين، أضف 50 µL من poly-D-lysine إلى كل بئر في غرفة زجاجية مكونة من ثمانية آبار وحضنها لمدة دقيقة واحدة لطلاء السطح، ثم اشفط المحلول واغسل مركز كل بئر بـ 50 µL من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، يتم استخدام التربسين على خلايا NIH 3T3 التي وصلت نسبة تلاحمها إلى 80-85%.

بعد انفصال الخلايا، أضف 10 milliliters من وسط DMEM الذي يحتوي على 10%FBS، وانقل 375 microliters من المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter، ثم قم بالطرد المركزي عند 1,500 G لمدة ثلاث دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، قم بشفط الوسط بعناية. أضف 750 microliters من وسط DMEM مع 10%FVS وقم بإعادة التعليق.

قم بتعليق الراسبة عن طريق سحب السائل ودفعه بلطف باستخدام الماصة عدة مرات. وأخيرًا، أضف معلق الخلايا إلى محلول عفن الخلايا (transfection solution)، وباستخدام طرف الماصة قم بالتقليب بلطف، ثم أضف 250 microliters من معلق عفن الخلايا إلى كل بئر من آبار الغرفة. قم بتمريرها وحضنها.

درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 15 إلى 18 ساعة. لتخليق cage rapamycin، biotin adduct. ابدأ بتحضير محلول مخزون بتركيز 1 mM من CRB في DMSO في أنبوب طرد مركزي معقم، وفي أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL، أذب 1 mg من avadon في 250 µL من PBS.

لربط جزء الحجب بـ rapamycin، أضف 0.5 µL من المحلول المخزن لـ CRB إلى AVID المذاب، واخلطه عن طريق القلب عدة مرات، ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وللحصول على محلول مرافق CRB AVID لاستبعاد الجزيئات الصغيرة غير المرتبطة وتنقية CRBA، قم بمعادلة عمود استبعاد الحجم G 25 باستخدام 300 µL من PBS.

كرر العملية خمس مرات بعد توازن العمود. قم بتحميل 125 µL من محلول CRBA على السرير المركزي للعمود. ثم قم بتدوير المحلول لمدة دقيقتين عند 800 ×g في درجة حرارة الغرفة، واجمع السائل المار في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL بعد عملية عفن الخلايا.

استبدل الوسط بوسط DMEM الخالي من FBS لتجويع الخلايا من المصل، ثم حضنها لمدة 12 ساعة. بعد فترة التحضين، اسحب الوسط برفق وأضف 250 µL من محلول CRBA المحضر بتركيز 1 µM. بعد ذلك، ولتصوير ديناميكيات البروتين في الخلايا الحية، استخدم مجهر كونفوكال بقرص دوار (spinning disc confocal microscope) مع إضاءة UV وبصريات مقترنة لمصباح UV LED بطول موجي 365 nm.

باستخدام ضوء الفلورة فوقي (epi fluorescence). يتم تحديد إحداثيات وحجم بقعة الإضاءة باستخدام لوح زجاجي مطلي بصبغات فلورية تُستثار بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (UV). وهذا يسمح بالضبط الدقيق للمنطقة المراد تشعيعها.

ضع شريحة الغرفة التي تحتوي على الخلايا على المنصة باستخدام عدسة شيئية 100x وتألق فوقي (epi fluorescence). قم بضبط بؤرة الخلايا وحدد خلية واحدة. بالنسبة للتصوير، ابدأ في تصوير الخلايا بعد تحديد مستويات الخلفية للتأثير الفسيولوجي.

هنا، يتم قياس تكمش الغشاء عن طريق تسليط الأشعة فوق البنفسجية UV على ربع واحد مختار من الخلية، لتحرير الراباميسين الذي كان مقيداً، حيث يتم إذابة الراباميسين الأصلي في DMSO ثم في PBS ليصل إلى تركيز نهائي قدره 400 nanomolar. أضف 100 µL من المحلول إلى غرفة التصوير لاستحثاث تأثيرات شاملة. التقط صور الفلورسنت كل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة لتحديد ما إذا كان التنشيط الموضعي لـ RAC يمكن أن يؤدي إلى تكوين تكمشات موضعية.

تم نقل خلايا NIH three T three باستخدام YFP tagged RAC activator FK bp و TIA one و LDR، وهو بروتين مثبت في الغشاء. تلا التشعيع الموضعي لـ FRB عند حافة الخلية، والمشار إليها بالدائرة الصفراء، إضاءة شاملة باستخدام مصباح زئبقي لمدة ثانية واحدة بدأت عند 1063 ثانية. وكما يتضح هنا، لم يكن هناك أي تكرمش غشائي تقريبًا في البداية.

ومع ذلك، بعد الإضاءة الموضعية، لوحظ حدوث تكشكش محصور مكانيًا، بينما لوحظ تكشكش عام بعد الإضاءة الشاملة وإضافة rapamycin، الذي يسبب انتقال FK bp TIA one إلى الغشاء البلازمي. أظهرت الخلية تشكيل تكشكش شامل، مما يشير إلى أن تشكيل التكشكش الموضعي الذي لوحظ سابقًا كان ناتجًا عن تنشيط محصور مكانيًا لـ rack. ولإجراء تحليل كمي، تم تقسيم الخلايا المستهدفة إلى أربعة أرباع، وتم تحديد تكرار تشكيل التكشكش في كل ربع عند التحفيز الموضعي وكذلك بعد التحفيز الشامل، كما هو موضح في هذا الرسم البياني.

لم تظهر أي من الخلايا الملحوظة تشكل الثنيات (ruffle formation) مع CRBA دون تشعيع UV أو تشعيع UV موضعي، أو تشعيع UV مع وجود أو عدم وجود Aden في الوسط العام. ومع ذلك، عند إضافة CRBA وإجراء تشعيع UV، لوحظ تشكل الثنيات بنسبة متقاربة تقريباً تبلغ 90% في جميع الأرباع عند استخدام التشعيع الشامل؛ بينما عندما تم تشعيع الربع الأول فقط، بلغت نسبة تشكل الثنيات 100% مقارنة بـ 30% و25% و30% في الأرباع من الثاني إلى الرابع. وتشير هذه النتائج إلى أن إزالة القفص الموضعية (localized uncaging) للراباميسين يمكن استخدامها لتحفيز تأثيرات فسيولوجية موضعية للغاية في خلية واحدة.

في هذه الحالة، يظهر تكشكش الغشاء الناتج عن تنشيط rack. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق تحكم مكاني زماني في نشاط small g TPAs بواسطة الضوء. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عملية فسيولوجية تعتمد على انتقال بروتينات محددة إلى الغشاء البلازمي.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير المحاليل والكواشف والخلايا حديثاً لكل عملية. ولا تنسَ أن العمل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء نظارات الحماية من الأشعة فوق البنفسجية.