Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Общая цель этой процедуры заключается в получении лентивирусных векторов для доставки трансгенов в клетки центральной нервной системы. Это достигается путем первого пересечения лентивирусных трансферных плазмид в хелперных плазмидах в 2 93 Т-клетки с использованием принципа осаждения фосфата кальция. Вторым этапом процедуры является очистка и концентрация супината вектора путем ультрацентрифугирования через 20%-ную подушку сахарозы.

Третьим этапом является определение титра вектора с помощью факсимильного анализа или количественной ПЦР в режиме реального времени. Заключительным этапом процедуры является трансдукция вектора в клетки-мишени. В конечном счете, эффективность трансдукции в зависимости от типа клеток может быть показана путем иммуноокрашивания клеток-мишеней, экспрессирующих трансген.

Основное преимущество нашей методики перед некоторыми другими существующими методами, такими как использование коммерческого набора, заключается в том, что она обеспечивает дорогостоящий, эффективный и надежный подход к производству лентивирусных векторов. Таким образом, этот метод может дать представление о доставке трансгенов в клетки ЦНС. Он также может быть применен к другим типам клеток in vivo и in vitro Лентивирусные векторы производятся путем cot, трансфекции плазмид в 2 9 3 Т-клетки.

Для этого эксперимента линия 2 9 3 Т-клеток должна быть сохранена в модифицированном DMEM. Засейте десять стомиллиметровых культуральных чашек с 2 9 3 Т-клетками при 30-40% слиянии. Через 20–24 часа после культивирования клетки должны быть на уровне около 80% конфлюенции и, следовательно, готовы к трансфекции.

Для трансфекции добавьте все необходимые плазмиды в 50 миллилитровую пробирку и заполните пробирку до 4,4 миллилитров TE 7 9 10. Затем добавьте 0,6 миллилитра двух моляров хлорида кальция и перемешайте пробирку, аккуратно подготовьте еще 50 миллилитровую пробирку с пятью миллилитрами двух XHBS. Добавьте смесь плазмиды и хлорида кальция в HBS Dropwise во время вортексирования смеси.

Теперь в течение следующих 30 минут дайте осадку деформироваться при комнатной температуре. Собирают посуду для культуры из инкубатора и после образования осадка подвешивают. С помощью вихря добавьте по одному миллилитру суспензии в каждую посуду по каплям.

При этом аккуратно взбалтывая среду в блюде. Коротко встряхните трубку, прежде чем переложить суспензию в следующую посуду. Верните загруженные тарелки в инкубатор.

Дайте плазмидам трансфектировать клетки в течение пяти часов. Через пять часов замените среду шестью миллилитрами среды, содержащей шесть миллимоляров. Бутират натрия.

Затем верните культуры в инкубатор на следующий день. Если использовался повсеместно выраженный флуоресцентный репортер, проверьте его экспрессию под флуоресцентным микроскопом. Обычно более 80% клеток экспрессируют репортерный ген.

Через двое суток после перефикации соберите САНЭ из посуды в две пробирки по 50 миллилитров, что должно составить около 30 миллилитров на пробирку. На этом этапе надосадочная жидкость может храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия, прежде чем продолжить. Начните с центрифугирования суперната, собранного с трансфекционных планшетов, чтобы удалить любой клеточный мусор.

Тем временем присоедините шприц объемом 60 миллилитров к шприцевому фильтру SFCA 0,2 микрона. Далее сцедите названный супер в шприц. Затем нажмите на пробку, чтобы отфильтровать супер имя в 38-миллилитровую полимерную центрифужную трубку, которая подходит для поворотного ротора.

Теперь загрузите пятимиллилитровую пипетку пятью миллилитрами 20% сахарозы в PBS. Вставьте пипетку на дно пробирки центрифуги, содержащей супернат, и медленно добавьте раствор сахарозы под векторный супернат. Теперь раскрутите SNAT в течение четырех часов в Beckman SW 28, сразу после отжима сцедите и выбросьте супернат и ресуспендируйте вектор, содержащий гранулу в 150 микролитрах 4%-ной лактозы в PBS, соберите все суспензии в одну 1,5-миллилитровую пробирку и дайте ей остыть в течение 15 минут на льду.

Далее смешайте суспензию методом пипетирования с последующим вращением ее в микроцентрифуге на полной скорости В течение одной минуты перенесите название супер в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра и разделите концентрированный вектор на 20 микролитров аликвот для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для титрования вектора сначала засейте HT 10-80 клеток в 12-луночный планшет с одним миллилитром дополненного DMEM в каждую лунку. После посева на ночь подсчитайте клетки из одной лунки и оцените номер клеток.

Теперь сделайте пятикратный серийный ряд разведения концентрированного вектора в культуральную среду. Затем добавьте по одному микролитру каждого разведенного вектора в отдельную лунку, образцы можно дублировать, но оставьте хотя бы одну лунку без вектора в качестве отрицательного контроля. Затем добавьте по одному микролитру поли мозга в каждую лунку и перемешайте тарелку, слегка встряхивая.

Верните тарелку в инкубатор на 48 часов. Через два дня удалите среду из каждой лунки и промойте ячейки ППС. Затем трипы анизируют клетки и ресуспендируют их в одной миллилитровой питательной среде с помощью пипетирования, переносят клеточные суспензии в пробирки объемом 1,5 миллилитра и центрифугируют их для сбора клеточных гранул.

Если векторы содержат флуоресцентный репортерный ген, ресуспендируют гранулу в 300 микролитрах 3,7% формальдегида в PBS, то определяют процент положительных клеток с помощью факсимильного анализа и рассчитывают титр. Если флуоресцентный репортерный ген не использовался, извлеките геномную ДНК из клеток с помощью коммерчески доступного набора. Затем амплифицируйте векторную последовательность с помощью ПЦР в реальном времени.

Создание стандартной кривой путем амплификации шаблонной последовательности из плазмиды с известным числом копий в десятикратном ряду разведения. Затем рассчитайте титр в единицах интегрирования на миллилитр. Получите культуры неокортекса, содержащие нейроны и глию, из коры головного мозга мышей с использованием ранее описанной двухэтапной процедуры в 24-луночном планшете для культуры тканей в дополненном MEM через пять дней.

В пробирке добавьте 10 микромолярных RSC для ингибирования деления ненейрональных клеток. Затем продолжайте культивирование в течение двух дней, стараясь не допустить пересыхания клеток во время смены сред. Через двое суток замените ЖК, содержащую среду, половиной миллилитра теплой свежеприготовленной среды.

Затем добавьте в культуру вектор с желаемым MOI и продолжайте культивирование клеток в течение 24 часов. Через 24 часа замените среду и через 48 часов, если есть репортер, проверьте ген клеток под флуоресцентным микроскопом, экспрессия репортера должна быть видна в нейронах через два-семь дней после трансфекции. В зависимости от дизайна вектора и дозы титры лентивирусных векторов, полученных по этому протоколу, варьируются от 10 до восьмой и от 10 до 10-й.

Единицы интеграции на миллилитр, что подходит для трансдукции in vitro или in vivo многих клеток ЦНС. Таким образом, культуры мю-неокортекса трансдуцировали лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP, контролируемым промотором синапсина или промотором A-G-F-A-P. Через семь дней после трансдукции проводили иммуногистохимическую обработку вектора, несущего промотор синапсина.

Более 90% нейронов, идентифицированных как новые конечные положительные клетки, экспрессировали GFP, в то время как астроциты, идентифицированные как GFAP-положительные клетки, не экспрессировали. Репортерный ген в клетках трансдуцируется векторами, содержащими промотор A-G-F-A-P. Около 80% астроцитов экспрессировали GFP, но ни один из новых и меченых нейронов не экспрессировал GFP.

Эти результаты демонстрируют, что лентивирусные векторы очень эффективны в доставке трансгенов к клеткам ЦНС. Кроме того, при использовании соответствующих промоторов может быть достигнута клеточно-специфическая экспрессия генов. Вирусные векторы Линдси широко используются для чрезмерной экспрессии и подавления генов, представляющих интерес в центральной нервной системе.

Наш протокол должен быть полезен другим исследователям, которые хотят использовать эти методы в своих лабораториях.