יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על

מטרת הניסוי הבא היא להקים ולתחזק תא היפוקסיה באמצעות שיטת זרימה רציפה. דבר זה מושג על ידי השגה וייצור של הפקתים, הבקבוקים והתאים הדרושים לפרוצדורה. כשלב שני, חברו את מיכל החמצן ובחרו את קצב הזרימה כדי ליצור את רמת ההיפוקסיה הרצויה.

הרט את הגז על ידי העברתו דרך בקבוק בועות מלא במים דה-יוניים. חבר את הגז המהורט לתא ההיפוקסיה והנח את דגימות הבדיקה בתא כדי לחשוף אותן לתנאי היפוקסיה. התוצאות המתקבלות מראות תמותה עוברית תלויה ב-Hi F1 בתנאי היפוקסיה, בהתבסס על תצפית על ההישרדות עד לבגרות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי כפפות (glove boxes), הוא שהיא קלה וזולה ליישום במעבדה ומספקת ריכוז מדויק וניתן לשחזור של גזים בתא הסביבתי. בעוד ששיטה זו מספקת תובנות לגבי התגובה להיפוקסיה בנמטודה *C. elegans*, ניתן להתאימה גם למערכות אחריות, כולל אורגניזמי מודל גדולים יותר ותרביות תאים. בנוסף, ניתן להשתמש בה למחקר של גזים אחרים, כולל פחמן דו-חמצני ומימן גופרתי.

פרוטוקול זה מדגים כיצד להקים תא היפוקסיה. גז מאוחסן במכלי גז דחוסים עם ריכוזי חמצן מוגדרים, ואליהם מחובר וסת רב-שלבי (two stage regulator). הגז נכנס לתחתית צינור הזרימה ויוצא מהחלק העליון בקצב הזרימה המתאים.

הגז זורם לאחר מכן אל בקבוק הבעבוע, שם הוא עובר הידרציה. גז המימן עובר לאחר מכן אל תא ההיפוקסיה דרך שסתום הכניסה, ובכך הוא חושף את הדגימות להיפוקסיה. לבסוף, הגז נפלט אל החדר דרך חור פליטה שנקדח בתא.

ניתן להשתמש בכלי התגבשות מפיירקס (Pyrex) או בקופסת ארו-פאק (arrow pack) כגוף של תא הסביבה. יש לשמור על נפח מינימלי של המכל, והחומר חייב להיות אטום לגזים. קדחו חור באחד מדפנות המכל באמצעות מקדח עם ראש פחמן או יהלום, וחושבו והרכיבו מחבר פלסטיק לצינור (hose barb fitting).

ערבבו את האפוקסי לפני היישום על הקופסה והמחבר. לאחר מכן, חזרו על אותו הליך בצדו השני של המיכל, כאשר החור השני ממוקם בהיסטה מהחור הראשון. כדי להגביר את הערבוב הטורבולנטי, השתמשו בפנמיקה של FEP או ניילון בעלת קוטר חיצוני של one eighth inch כדי לחבר את מיכלי הגז הדחוס להתקן בקרת זרימה, כגון בקר זרימה המוני (mass flow controller) או רוטומטר.

מכלי הגז צריכות להיות ריכוזי חמצן מוגדרים המאוזנים עם חנקן, המהווים תקן מאושר לתכולת חמצן או לתנאים אנוקסיים. עבור חנקן טהור, השתמשו בווסת דו-שלבי כאשר השלב השני מכוון ללחץ הרצוי. עיינו בהוראות בפרוטוקול הכתוב לבחירת קצב זרימה מתאים.

לאחר מכן, חברו את הפחית מהווסת הדו-שלבי למדיד הזרימה השולט על קצב זרימת הגז הנכנס לתא. מוצאי מדיד הזרימה מחוברים לבקבוק שטיפת גז עם גליל פריט המכיל מים מזוקקים. לאחר מכן, חברו את הפחית מהצד השני של בקבוק השטיפה לאחד מהחיבורים בתא הסביבתי.

פעולה זו תלחח את הגז הנכנס לתא הסביבתי. השתמשו בחומרי סיכה לוואקום כדי לאטום את התא. לאחר מכן, הניחו משקולות על מכסה התא כדי להבטיח אטימה הרמטית.

בדקו את האטימה על ידי הצמדת כמות קטנה של מים על כף יד עם כפפה למחבר פליטת הגז של התא ובדיקה אם נוצרות בועות. ראשית, ייצרו אוכלוסיות מסונכרנות של תולעי sea Elgan. הניחו בין 1 ל-100 תולעי GR בוגרים בטיפה של תמיסת תמיסת הלבנה בסיסית על פני פיתח של מצע גידול לנמטודות שאינו זרוע.

אפשרו לתמיסת התבהטן להיספג בתוך הצלחת לאחר תקופת דגירה של שמונה שעות לפחות. העבירו את ה larvae בשלב L1 הסנכרוניים לצלחת הזרועה בחיידקי OP 50 חיים. לחלופין, אפשרו למבוגרים GRA להטיל ביצים על הצלחת למשך שתי עד שלוש שעות כדי ליצור קבוצה של תולעים שיפתחו באופן סנכרוני, או בחרו larvae בשלב L4 מתוך אוכלוסייה מעורבבת כדי לאסוף עוברים צעירים.

בשלב של שני עד ארבעה תאים, השתמשו בלהב תער כדי לקצוץ את תולעי ה-GR הבוגרות בנפח קטן של מים, ולאחר מכן העבירו את העוברים באמצעות פיפטה פה לפני העברת התולעים לצלחת לחשיפה לתנאי היפוקסיה. הניחו טבעת של 10 mg/mL של חומצה פלמיטית באתנול מסביב לקצות הצלחות, כדי למנוע מהתולעים לברוח מפני השטח של צלחת האגר.

חומצה פלמיטית תשקע מהתמיסה. ככל שהאתנול מתאדה ויוצר מחסום פיזי להבטחת אחידות, הקפידו להחליף את המים בבקבוק השטיפה של הגז לפני החשיפה בתא הסביבתי. לאחר העברת התולעים לצלחות, אטמו את הצלחות בתוך התא הסביבתי, התחילו את זרימת הגז והמשיכו בחשיפה למשך הזמן הרצוי לבדיקה.

על מנת לבחון את חיוניות העוברים עד לבגרות, יש לאפשר לתולעים להתפתח במשך 48 שעות לאחר החזרתן לאוויר החדר, נקודה שבה הן צריכות להיות בלרבה השלב הרביעי או בוגרות בנות יום אחד; לאחר מכן יש להעריך את החיוניות עד לבגרות. כדי להמחיש את התולעים שנחשפו להיפוקסיה, העבירו את התולעים לטיפה של M9 על כיסוי זכוכית ריבועית של 22 מ"מ והפכו אותה על גבי רפידה של 2% agarose ב-M9 במידת הצורך.

ניתן להשתמש ב-25 millimolar של amol או ב-10 millimolar של sodium azide כחומר הרדמה. לחלופין, לאחר חשיפה להיפוקסיה, ניתן להניח את תא הסביבה השקוף ישירות על משטח הבמה של מיקרוסקופ dissecting. מוצגות שתי תצפיות, אחת מהן כוללת את כל מערך זרימת הגז.

השני עם התא בלבד על בסיס המיקרוסקופ. גדלו תולעי Bristol N2 בארבעה פלטות גידול בגובה 10 סנטימטר עד שרוב התולעים הן בוגרים בשלב GR. שטפו את התולעים לתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר עם תמיסת הלבנה בסיסית בדילול של 1:5 והדגירו עם סיבוב עד שהתולעים מתחילות להתמוסס.

לא יותר מחמש דקות. שטפו את התולעים שלוש פעמים ב-M9, תוך סבוב (spinning down) ב-1,500 ×g בין שטיפה לשטיפה ללא שבירת הפלטה. העבירו את העוברים המולבנים ל-8 פלטות NGM של 150 מילימטר ואפשרו לעוברים להתפתח ללרוות בשלב L4 במשך כ-48 שעות.

בטמפרטורה של 22 °C, העבירו את הפלטות לתא הסביבתי וחשפו אותן לתנאים היפוקסיים ואנוקסיים למשך ארבע שעות או למשך הזמן שנקבע בתכנון הניסוי. כדי לאסוף דגימות, הסירו במהירות את המכסה של התא ההיפוקסי. קחו פלטת דגימה אחת ואטמו מחדש את התא, ולאחר מכן רשמו את השלבים.

לאחר הוצאת התולעים מההיפוקסיה, תהליך זה כולו צריך להימשך פחות משתי דקות. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את התולעים אל מסנן ניילון ולאחר מכן שפוך אותן למבחנה קונית מסומנת בנפח 15 מיליליטר המכילה 100 µL של 1% SDS. סבב את התולעים ב-SDS בצנטריפוגה שולחנית במהירות של 1,500 ×g למשך 15 עד 20 שניות.

בעזרת שבירה, השתמשו בוואקום כדי להסיר את רוב הנוזל מהמבחנה, תוך השארת משקע התולעים ללא פגיעה. בעזרת פיפט, העבירו את משקע התולעים עם נפח נוזל שנקבע מראש למבחנת מיקרו 1.5 μL מסומנת. אם הדגימה מיועדת ל-SDS page, ניתן להוסיף למבחנה נפח שווה של צבע טעינת חלבון בריכוז פי שניים; אטמו את המבחנה ושקיעו אותה בחנקן נוזלי.

חזור על הפעולה עד לבידוד כל הדגימות. פעל לפי נהלים אלה גם עבור דגימות ביקורת של אוויר בבית לצורך עקביות; ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. איור זה מראה את חיוניות העוברים שנחשפו ל-1000 parts per million oxygen, 5,000 parts per million oxygen ולנורמוקסיה של כ-210,000 parts per million of oxygen.

העוברים נחשפו לכל תנאי למשך 24 שעות בתאי חמצן בעלי זרימה רציפה. התולעים הועברו לתנאי נורמוקסיה והושארו להתפתח לבגרות במשך 48 שעות, ולאחר מכן נבדקה חיוניותן עד לשלב הבגרות. בעקבות הליך זה, ניתן לאסוף דגימות לניתוח המשכי באמצעות Western blot, QPCR או בדיקות פיזיולוגיות כגון אורך חיים או ייצור צאצאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להקים תא היפוקסיה בזרימה רציפה במעבדה שלכם.