Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623 Cryptosporidium Ve Giardia spp.

Bu prosedürün genel amacı, su kaynaklı, cryptosporidium ve giardia türlerini tespit etmek ve görselleştirmektir. Bu, önce su numunesinin teğetsel akış, içi boş elyaf, ultra filtrasyon kullanılarak konsantre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir santrifüjleme adımını takiben organizmaları uzaklaştırmak ve filtredeki kalıntıları yakalamaktır.

İmmünomanyetik ayırma, parazitlerin konsantre döküntülerden seçici olarak ayrılmasına izin verir. Manyetik boncuklar, ısı ayrışması ile parazitlerden ayrılır ve bir mıknatıs kullanılarak çıkarılır. Kistler ve O kistleri daha sonra bir lam üzerine yerleştirilir ve numune, immünofloresan mikroskobu ile görselleştirme için boyanır.

Hofi filtrasyonun mevcut tekniklere göre ana avantajı, ultra filtrenin önemli ölçüde daha ucuz olması ve virüsler ve bakteriler gibi Cryptosporidium ve Giardia'ya ek olarak birden fazla mikroorganizmayı yakalamasıdır. Genel olarak, immüno-ayırma konusunda yeni olan bireyler, çok iklim koşullarından gelen farklı numunelerle ilişkili enkaz miktarı ve türü ile karşı karşıya kalacaktır. Ultra filtrasyon cihazını bir biyogüvenlik kabini içine monte ederek başlayın.

Cihaz monte edildikten sonra aşağıdaki gibi çalışır, su numunesi siyah T konektöründen geçerek sisteme girer ve pompa kafasından basınç göstergesinden geçer ve içi boş fiber ultra filtreye girer, filtrelenmiş su filtrenin yanından atık kabına geçer. Organizmaları içeren tutulan su, retent bant şişesine zorlanır ve su hacmi azalana kadar sistem boyunca yeniden dolaştırılır. Prosedüre başlamak için, havalandırma kapağını çıkarın ve retenate şişesinin suyla dolmasına izin vermek için kapatılması gereken kıskaç kelepçesi iki dışındaki tüm kelepçeleri açın, pompa yönünü su numunesi filtreye akacak şekilde ayarlayın.

Ardından pompa hızını %25'e ayarlayın ve renate şişesinin üçte ikisi tamamen açıldığında pompayı açın. Kelepçeyi iki sıkıştırın ve havalandırma kapağını kullanarak şişeyi hızla sıkıca kapatın. Sızıntı olmadığından emin olmak için tüm hatları ve bağlantı parçalarını kontrol edin.

Ardından, dereceli bir silindir ve zamanlayıcı veya akış ölçer kullanarak pompa hızını yavaşça dakikada yaklaşık 1,5 litreye yükseltin, filtrat hızının, atık su hattından çıkan suyun oranının gerçekten dakikada 1,5 litre olduğunu doğrulayın. Filtrasyon işlemini izleyin, reten şişesinin asla boşalmadığından emin olun, ancak hacim biraz artabilir veya azalabilir. Ses seviyesi üçte birin altına düşerse, havalandırma kapağını çıkarın ve kıstırma kelepçesini kapatın.

Yine, şişedeki hacmin üçte ikiye yükselmesine izin verin. Ardından havalandırma kapağını sıkıca yerine takın ve kelepçeyi tekrar açın. Numune kabı boşaldığında, sıkıştırma kelepçesini hemen kapatın, pompa hızını %20'ye düşürün, havalandırma kapağını retent ate şişesinden çıkarın ve rampayı kapatınamp filtre sütunu atık su tüpünü atık tankına bağlayan kelepçe.

Retent ate şişesindeki hacmi yaklaşık 200 mililitreye ayarlamak için rampa kelepçesini sıkın veya gevşetin. Ardından, elucian'ın numuneyi boşaltması için rampa kelepçesini sıkın. İlk olarak, numune kabına 500 mililitre elucian çözeltisi ekleyin ve işlem sırasında kabın içini durulayın.

Ardından, numune alım hattına bağlı 10 mililitrelik pipeti elucian çözelti kabına yerleştirin. Elucian çözeltisini hazırlamak için bir tutam kelepçesini açın ve iki tutam kelepçesini anlık olarak kapatın. Tüm çözelti yüklendikten sonra, bir tutam kelepçesini kapatın, iki tutam kelepçesini açın ve çözeltinin% 20'lik bir pompa hızıyla beş dakika boyunca dolaşmasına izin verin, renat şişesindeki numunenin hacmini yaklaşık 100 mililitreye ayarlamak için rampa kelepçesini sıkın veya gevşetin.

Ardından rampa kelepçesini tamamen sıkın ve numunenin bir dakika boyunca yeniden dolaşmasına izin verin. Bu noktada, pompanın yönünü 20 saniye ters çevirin. Bu, tat şişesinde yaklaşık 225 mililitre numune birikmesine neden olacaktır.

Ardından pompayı kapatın. Hortumu pompa kafasından ve filtreden çıkan hortumdan çıkarın ve kalan s'yi zorlamak için hortumu tate şişesinin üzerinde tutun.ampşişenin içine girmeye. Ardından tüm boruları şişeden ayırın ve havalandırma kapağını havalandırmayan bir kapakla değiştirin.

Konsantre numuneyi 250 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Renate şişesini 10 mililitre reaktif su ile iki kez durulayın ve durulama sıvısını santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 15 dakika boyunca en az 1500 kez G santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi durdurmak için ara vermeyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı peletin beş mililitre üzerine dikkatlice aspire edin. Sıvı seviyesinin en üstünde kalmak için ekstra özen gösterilmeli ve pelet içindeki O kistleri ve kistleri aspire etmekten kaçınılmalıdır.

Peleti iyice yeniden askıya almak için tüpü girdaplayın. Daha sonra numuneyi, her biri 10 X SL tampon A ve tampon B'den oluşan bir mililitre içeren düz kenarlı bir dyal L 10 tüpüne aktarın. Santrifüj tüpünü 2,5 mililitre reaktif su ile iki kez durulayın ve durulama solüsyonunu dyal L 10 tüpüne ekleyin. Son hacmi 12 mililitreye getirerek, tüpe her biri 100 mikrolitre manyetik boncuk konjuge, anti cryptosporidium ve anti giardia antikorları ekleyin.

Daha sonra tüpü, döndürdükten sonra dönen bir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca 18 RPM'de döndürün. Tüpün düz tarafını MP six mıknatısına yerleştirin ve tüpü mıknatıstan çıkarmadan tüpü iki dakika boyunca hafifçe sallayın. Düz tarafı yukarıda tutun ve süpernatanı boşaltın.

Tüpün düz tarafında, mıknatısın yanında tutulan boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin. Numune tüpünü mıknatıstan çıkarın ve tüpün düz tarafını 500 mikrolitre tampon A ile üç kez durulayın, tüpün yuvarlak tarafındaki kalıntıları önleyin. Her durulama hacmini bir MPCS mıknatısının içinde tutulan 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Mıknatıs dikey konumdayken. Tüpü kapatın ve bir dakika boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra mıknatıs yerindeyken, tüpün altına yerleştirilmiş bir mera pipeti kullanarak süpernatanı aspire edin, tüpe yavaşça bir mililitre PBS ekleyin.

Boncuk peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Mıknatısın yanındaki tüpün duvarına takın. Manyetik şeridi çıkarın ve boncuklar yeniden askıya alınana kadar tüpü hafifçe sallayın.

Manyetik şeridi dikey konuma yeniden yerleştirin. Tüpü bir dakika boyunca nazikçe sallayın ve süpernatanı aspire edin, boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla kalıntıyı temizleyin. Bu yıkamadan sonra mıknatısı çıkarın ve 50 mikrolitre reaktif suyunu doğrudan boncuk paletine ekleyin.

Boncukları yeniden askıya almak için tüpü 50 saniye boyunca tam hızda girdaplayın. Daha sonra numuneyi 80 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, Giardia kistlerinin ve cryptosporidium o kistlerinin boncuklardan ayrılmasına izin verin İnkübasyondan sonra numuneyi 30 saniye vorteksleyin. Ardından, boncukları süspansiyondaki kistlerden ve O kistlerinden ayırmak için eğimli pozisyonu kullanarak manyetik şeridi MPCS'ye yerleştirin.

Kistleri ve O kistlerini içeren süpernatanı iyi bir slayta aktarın. Su ekleme, girdap ve ısı ayrışma adımlarını ikinci kez tekrarlayın ve süpernatanı aynı slayta ekleyin. Ardından, süspansiyonu kurutmak için sürgüyü 37 santigrat derecelik bir sürgü ısıtıcısına yerleştirin.

Numuneyi sabitlemek ve oda sıcaklığında kurumasını sağlamak için slayta 50 mikrolitre metanol uygulayarak başlayın. Daha sonra, 50 mikrolitre DPI çözeltisi ekleyin ve slaydı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Çekirdekleri lekelemek için, kuyuya dokunmamaya dikkat ederek benekli kuyudan çıkarmak için bir Kim mendili kullanın.

Daha sonra Giardia kistlerinin ve cryptosporidium o kistlerinin hücre duvarını boyamak için 50 mikrolitre kolay leke ekleyin. Numuneyi 35 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Lekeyi daha önce olduğu gibi Kim mendiliyle çıkarın.

Ardından, pipet ucunu kuyunun dışına dikkatlice yerleştirerek ve sıvının kuyuya girmesine izin vererek yavaşça 300 mikrolitre soğuk kolay leke sabitleme tamponu ekleyin. Slaytı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Daha sonra bir kim, mendil kullanarak tamponu çıkarın ve 10 mikrolitre montaj ortamı uygulayın, numunenin üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin, kabarcıkları çıkarın ve kapak fişini şeffaf oje ile kapatın Bir floresan mikroskobu kullanarak, slaydı 200 x ila 1000 x büyütmede ve bir fse'de inceleyin, ardından 200 x büyütmede DPI filtresi kistler ve O kistleri, parlak elma yeşili floresan oval yapılar olarak görünür. vurgulanan kenarlar.

Cryptosporidium O kistleri yuvarlaktır ve boyutları dört ila altı mikron arasında değişir. Giardia kistleri daha büyüktür, genişliği beş ila 15 mikron ve uzunluğu sekiz ila 18 mikrondur ve 1000 x büyütmede yuvarlak veya oval olabilir. Ve DPI filtresini kullanarak, kistlerin ve CYS'nin iç yapısı daha iyi takdir edilebilir.

Tipik olarak, gök mavisi DPI leke çekirdekleri olarak görünen dört adede kadar sporozoit, Cryptosporidium O cys ve Giardia Cys.DIC içinde görülebilir. Mikroskopi, ek morfolojik özellikler takdir edilebileceği için parazitlerin uygun şekilde tanımlanmasına da yardımcı olabilir. Cryptosporidium sporozoitler DIC ile görülebilir Giardia kistleri genellikle görünür çekirdekler, medyan cisimler olarak adlandırılan hilal şeklindeki organeller ve akson olarak adlandırılan iç kamçılı yapılar gibi bir veya daha fazla ayırt edilebilir iç yapı sergiler.

Holo fiber ultra filtrasyon prosedürünün birden fazla mikroorganizmayı yakalama yeteneğine sahip olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ek olarak, konsantre numunelere QPCR ve genotipleme gibi diğer tespit testleri uygulanabilir, bu da bu yöntemi daha esnek ve uygulamalarınıza daha uyarlanabilir hale getirir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve herhangi bir sorunuz varsa bize bildirin.