الميكانيكية حفز خلية غضروفية-الاغاروز الهلاميات المائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق التحميل الانضغاطي الميكانيكي الديناميكي على الهلاميات المائية المصنفة بالخلايا. للقيام بذلك ، يتم الحصول على الخلايا الأولية من خلال تشريح شرائح الغضروف والهضم الأنزيمي. يتم تغليف الخلايا المعزولة في 2٪ agros ، ويتم إنشاء هيدروجيل ، ويتم إنشاء تركيبات بذرة الخلايا باستخدام لكمة خزعة.

ثم يتم وضع العينات في جهاز التحميل الانضغاطي وتحميلها في محفز ميكانيكي صغير واحد ماخ. ثم يتم تطبيق التحميل الانضغاطي الديناميكي على التركيبات المصنفة للخلايا لتقييم تخليق الكولاجين والبروتين الجليكان. يتم تصنيف التركيبات على الراديو بعد دمج الحضانة.

يتم قياس النظائر عن طريق حساب التلألؤ للبيانات الناتجة ، والتي يتم تطبيعها إلى الحمض النووي. يظهر المحتوى تغيرات في تخليق المصفوفة خارج الخلية بعد التحفيز الميكانيكي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستجابة الموقع المضاد والتحفيز الميكانيكي.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الخلايا الجذعية أو الأنسجة الضامة الأخرى أو الخلايا المستقبلة للميكانيكو. تم الحصول على مفاصل مشط المفاصل من الأبقار الناضجة الهيكلية المستخدمة هنا من مسلخ محلي يعمل في منطقة تشريح معقمة. في غطاء التدفق الصفحي ، ضع شرائح الغضروف في طبق بتري بقطر 100 ملم يحتوي على 20 مل من لحم الخنزير ، F 12 يحتوي على 0.5٪ بروتياز واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد فراغ الحضانة ، قم بشفط محلول البروتياز واشطف الشرائح بإضافة لحم الخنزير. F 12 وسط ثقافة يدور برفق ، ثم يتنشق. كرر هذا ، اغسل مرتين أخريين بعد الغسيل الثالث ، وقم بشفط وسط الثقافة بالمكنسة الكهربائية.

أضف 20 مل من لحم الخنزير F 12 الذي يحتوي على 0.15٪ كولاجيناز أ واحتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتشغيل ماصة تعليق الخلية من خلال مرشح شاشة شبكية 200 في طبق بتري نظيف لغسل الفلتر ، وقم بسحب خمسة ملليلتر إضافي من لحم الخنزير F 12 ، وجمع التدفق في نفس الطبق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

اغسل طبق بتري مع 10 مل من لحم الخنزير F 12. ثم أضف محلول الغسيل إلى الأنبوب المخروطي. الطرد المركزي للأنبوب عند 600 إلى 800 RCF لمدة ست إلى ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد اكتمال الدوران ، قم بشفط المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات في 40 مل من وسط الاستزراع. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 600 إلى 800 RCF لمدة ست إلى ثماني دقائق.

كرر الشفط وتعليق الإعادة والطرد المركزي مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث مرات قبل الدوران الثالث. ريسوس. الحنك عن طريق التحريض وخذ 500 ميكرولتر لحساب الخلايا. خلال الدوران الثالث ، استخدم مقياس الخلوي الدموي والمجهر الضوئي المقلوب لحساب الخلايا القابلة للحياة في الاقتباس عن طريق استبعاد الأزرق الثلاثي.

ثم بمجرد تحديد رقم الخلية ، واكتمال الدوران الثالث ، قم بشفط snat و resus. قم بتعليق الحبيبات في حجم وسط الثقافة بضعف كثافة الجلوس المطلوبة. هنا يتم تعليق الخلايا الغضروفية عند 20 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

الخطوة التالية من الإجراء هي تغليف الخلايا الغضروفية المفصلية الأولية المعزولة في هيدروجيل aros في دورق معلق 0.8 جرام من aros. في 20 مل من PBS المعقمة. ضع الدورق على طبق ساخن على 120 درجة مئوية بمجرد ذوبان الحشار.

اخفض الحرارة إلى 60 درجة مئوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اجمع بين كميات متساوية من تعليق الخلية مع ضعف التركيز المطلوب لمحلول aro الساخن. هنا ، يضاف خمسة ملليلتر من تعليق الخلية إلى خمسة ملليلتر من المعلق الزراعي بنسبة 4٪ للحصول على مزيج نهائي من هيدروجيل Agros بنسبة 2٪ جيدا عن طريق سحب العينات مع تجنب تكوين فقاعات كبيرة قد تؤثر على بقاء الخلية.

بعد ذلك ، قم بعمل 10 ملليلتر من خليط الصناعات الغضروفية بعناية في طبق بتري بقطر 60 ملم. مرة أخرى ، تجنب تكوين فقاعات كبيرة. غطي الطبق بالغطاء.

ثم اترك الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يتجمد الخليط ، استخدم خزعة بأربعة ملليمترات للحصول على أكبر عدد ممكن من عينات هيدروجيل الخلايا الغضروفية الزراعية. عادة ، يصل هذا إلى 20 إلى 30.

ضع العينات في طبق بتري نظيف باستخدام مقياس ميكرومتر وسجل قطر وارتفاع كل عينة. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون ارتفاع البناء حوالي خمسة ملليمترات ، وتخلص من أي عينات تم الحصول عليها من منطقة يكون فيها ارتفاع العينة أكبر من 2٪ انقل العينات إلى طبق بتري جديد مقاس 60 ملم يحتوي على 10 ملليمترات من الوسط الكامل. في هذا الجزء من البروتوكول ، سيتم تحفيز التركيبات الموجودة في الخلية ميكانيكيا عن طريق الضغط الديناميكي.

سيتم تحقيق ذلك باستخدام جهاز ضغط مصمم خصيصا يجمع ميكانيكيا بين PLAs التي تحمل البناء بنظام ميكانيكي دقيق واحد ، والذي يتحكم في مقدار الضغط المطبق على الأبنية. أصعب جانب في الإجراء هو تحميل العينات في جهاز الضغط. من المهم ضبط الألواح في الحفارة بشكل صحيح لضمان التطبيق المناسب للتحميل الانضغاطي الديناميكي.

قبل الاستخدام ، قم بتعقيم المكونات المعدنية لجهاز الضغط في الأوتوكلاف. قم بتعقيم المكونات البلاستيكية بنسبة 70٪ من الإيثانول طوال الليل وضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على الأقل. للحفاظ على الخلايا الغضروفية تثير تركيبات الهيدروجيل من السقوط.

استخدم الملقط لوضع 12 حلقة احتجاز بلاستيكية معقمة في آبار لوحة ثقافة 24 بئرا. يجب أن تكون الأقطار الداخلية لحلقات التثبيت أكبر من أقطار البناء. باستخدام ملقط بعناية.

انقل الهلاميات المائية chondro aros من طبق Petri إلى لوحة 24 بئر ، مع تأمين كل واحدة في حلقة احتفاظ. انقل 400 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل عينة. حسنا بعد ذلك قم بتجميع جهاز الضغط المعقم وباستخدام براغي التثبيت ، قم بتأمين جيش التحرير الشعبى الصينى.

قم بتوصيل جهاز الضغط بلوحة ثقافة 24 بئر لإنشاء تحرير ملامسة هيدروجيل وإعادة تأمينها. سيتم تطبيق تشوه بناء مسامير المجموعة على هذه الحالة المرجعية غير المحملة أو حالة الإجهاد الصفرية. قم بتحميل جهاز الضغط المجمع في نظام اختبار ميكانيكي دقيق Mach one باستخدام دبوس تحديد الموقع.

قم بتثبيت الحفارة في المرحلة الرأسية ثم باستخدام برغي التثبيت ، قم بتثبيتها في مكانها. قم بإزالة الرقصة المباعدة استخدم واجهة برنامج Mach one لضبط التردد على هرتز واحد ، والسعة إلى 350 ميكرون وعدد الدورات إلى 1 ، 200.

هذا يطبق التحميل الانضغاطي الديناميكي على سعة إجهاد 10٪ بناء على الارتفاع الأصلي للعينات. لبدء التحفيز الميكانيكي ، اضغط على زر البدء ، مشغل ماخ واحد. يحتوي جهاز التحميل الذي يتم توصيله على لوحة الثقافة على ستة مسافة بادئة تتحرك لأعلى ولأسفل ، مما يحفز ست عينات في وقت واحد.

عينات التحكم غير المحفزة أيضا في نفس لوحة الاستزراع ، ولكن لا يتم وضعها في الآبار التي تحتوي على المسافات البادئة. عند اكتمال التشغيل ، سيصدر صوت ماخ وسينتقل المشغل إلى الحالة المرجعية غير المحملة. عند الانتهاء من التحفيز الميكانيكي ، استبدل رقصة التباعد.

بفك برغي مجموعة دبوس تحديد الموقع ، وقم بإزالة جهاز الضغط ولوحة الثقافة من نظام الاختبار بجوار ملصق الراديو ، يقوم هيدروجيل الخلية ببناء ماصة على حد سواء خمسة كوري صغير من ملصق بروتين Tritium Prolene لتخليق الكولاجين الخاص بالخلايا الغضروفية و S 35 الكبريت لتخليق البروتيوغليكان في كل منها ، واحتضان التركيبات الراديوية المسماة جيدا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لحصاد تركيبات الهيدروجيل المسمى بالراديو. استخدم الملقط لشطف كل تركيبة هيدروجيل ثلاث مرات عن طريق الغمر في PBS. لإزالة أي نظير غير مدمج ، ضع الهيكل المغسول في أنبوب سعة 1.5 مل.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول Pape إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. ضعها على كتلة تسخين واتركها تهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بمجرد اكتمال الملخص ، يجب أن تبدو العينة واضحة نسبيا.

مباشرة بعد هضم الصفحه ، خذ حصصا من 100 ميكرولتر من كل عينة لتحديد محتوى الحمض النووي باستخدام مقايسة بيكو الخضراء D. ثم خذ حصة 100 ميكرولتر من كل عينة لتحديد نشاط النظائر المدمج عن طريق عد التلألؤ السائل بيتا. يجب بعد ذلك تطبيع نشاط النظير الناتج إلى محتوى الحمض النووي لتحليله.

الخلايا الغضروفية المفصلية البقرية تثير تركيبات هيدروجيل تتكون من 2٪ aros مع 10 في 10 إلى السادسة. تم تحفيز الخلايا لكل مليلتر من الخلايا المغلفة ميكانيكيا بسعة 10٪ من الإجهاد الانضغاطي بتردد هرتز واحد لمدة 20 إلى 60 دقيقة ، أو 1 ، 200 إلى 3 ، 600 دورة. ثم تم فحصها لمحتوى الحمض النووي وتوليف المصفوفة خارج الخلية عن طريق دمج النظائر المشعة.

كما يتضح هنا ، تأثر الحمض النووي وتخليق المصفوفة خارج الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهر محتوى الحمض النووي انخفاضا كبيرا بنسبة 35٪ نتيجة 20 أو 30 دقيقة من التحفيز مع قيمة p أقل من 0.01 60 دقيقة من التحفيز لم تظهر أي تأثير. تم تحديد تخليق الكولاجين والبروتيوغليكان الخاص بالغضروف عن طريق دمج الكبريت التريتيوم والبرولين و S 35 على التوالي.

أظهرت هذه زيادات كبيرة بنسبة 60٪ تقريبا استجابة ل 20 أو 30 دقيقة من التحفيز مع قيمة p أقل من 0.01 60 دقيقة من التحفيز لم تظهر تأثيرا ملحوظا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز ثقافات الهيدروجيل ميكانيكيا باستخدام الانطباع الديناميكي وتكييف هذا البروتوكول للاستخدام في تطبيقات مماثلة.