بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

الهدف العام من التجربة التالية هو تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو H PSCs إلى عصبونات باستخدام تنسيق أطباق متعددة العيارات. ويتم تحقيق ذلك من خلال حصاد وزراعة معلق خلوي مفرد من H PSCs في أطباق ذات 96 بئراً بقاع على شكل حرف V لتكوين أجسام جنينية أو EBS طوال الليل.

بعد ذلك، تُنقل أجسام الاستنبات الجنينية (EBS) إلى أطباق ذات قاع على شكل حرف U فائقة انخفاض الالتصاق تحتوي على وسط تمايز لتحفيز تكوين الأديم الظاهر العصبي. لاحقاً، تُزرع أجسام الاستنبات الجنينية في أطباق مطلية بالماتريجيل (matrigel) لتعزيز نمو الخلايا العصبية. ويمكن الحصول على نتائج تُظهر وجود علامات عصبية نموذجية في اليوم الثامن تقريباً عن طريق التألق المناعي.

غالبًا ما تكون بروتوكولات الصبغ المخصصة لتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى عصبونات معقدة ومضنية. وبمحض الصدفة تقريبًا، توصلنا إلى إجراء بسيط للغاية لإنتاج عصبونات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

من وجهة نظر تقنية، تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في سهولة تنفيذها وسرعتها وكفاءتها من حيث التكلفة. وفي الوقت ذاته، سيقوم الدكتور MI Z من المختبر بعرض هذا الإجراء. قم بتحضير وسط تكوين أجسام مضغية (EB formation medium) ووسط التمايز (differentiation medium) وفقاً لما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بتنمية الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (h PSCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية، مثل استخدام وسط مُكيَّف بـ meth على أطباق مغلفة بـ matrigel، أو باستخدام أنظمة استزراع محددة كيميائياً تحت ظروف نمو نشطة دون الوصول إلى مرحلة التلاقي الكامل. وباستخدام مجهر ستيريو مع طرف ماصة بلاستيكي معقم، قم بإزالة المستعمرات المتمايزة تلقائياً ميكانيكياً. اغسل المستعمرات غير المتمايزة المتبقية باستخدام PBS واستخدم Accutane الذي يحتوي على one x rock inhibitor لهضمها إلى خلايا مفردة.

قم بترسيب الخلايا المفردة عن طريق الطرد المركزي عند 200 G لمدة دقيقتين، ثم أعد تعليقها في حجم صغير من وسط تكوين الأجسام الجنينية (EB). استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لتحديد عيار الخلايا. أضف خلايا إضافية إلى ما تبقى من وسط تكوين الـ EB للوصول إلى عيار يتراوح بين 40,000 و 80,000 خلية لكل milliliter.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 100 µL لكل بئر إلى طبق 96 بئر ذو قاع على شكل حرف V، بحيث يتراوح عدد الخلايا من 4,000 إلى 8,000 خلية لكل بئر. قم بتدوير الطبق في جهاز طرد مركزي للأطباق بنظام التأرجح عند 400 ×g لمدة دقيقة واحدة لتجميع كافة الخلايا في قاع الآبار. انقل الخلايا إلى الحاضنة واترك الـ EBS تتكون طوال الليل، ثم افحصها في اليوم التالي تحت المجهر الستيريو.

اجمع الخلايا الجذعية الجنينية (EBS) وانقلها في حجم صغير إلى طبق بكتيري بقطر 3.5 سنتيمتر يحتوي على 2 ملليلتر من وسط التمايز. اغسل الخلايا عن طريق تدوير الطبق برفق. أضف 100 ميكرولتر من وسط التمايز إلى كل بئر في طبق فائق انخفاض الالتصاق.

لوحة ذات 96 بئراً في الأسفل تحت مجهر ستيريوسكوب. انقل EBS بكميات صغيرة من وعاء الغسيل إلى الآبار الـ 96 ذات شكل U. قم بحضن EBS لمدة أربعة أيام للسماح بتكوين الأديم العصبي في اليوم الرابع.

اغسل الخلايا في وسط التمايز ثم وزعها واحدة تلو الأخرى في آبار لوحة متعددة العيارات مطلية بالـ matrigel، مثل لوحة ذات 12 بئرًا. يجب توزيع الخلايا بالتساوي داخل الآبار للسماح بنمو العصبونات دون أي تداخل. اترك الـ EBS تلتصق بشكل فضفاض بالـ matrigel لمدة 10 دقائق تقريبًا في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل الطبق بعناية إلى الحاضنة. ستنمو الخلايا العصبية من أجسام الاستباق الجنينية (EBS) المزروعة بشكل شعاعي خلال الأيام الأربعة التالية. وقد أظهرنا سابقاً، تماشياً مع العديد من الدراسات الأخرى، أنه يمكن توليد أجسام الاستباق الجنينية (EBS) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (H PSCs) ببساطة عن طريق إعادة زراعة التجمعات الناتجة عن التقسيم الروتيني للخلايا السلفية الدموية البشرية (H HPCs) في أطباق منخفضة الالتصاق.

يؤدي هذا عادةً إلى توزيع واسع لأحجام الخلايا. وتتمثل مشكلة أخرى في أن الأجسام الجنينية (EBs) التي يتم الحفاظ عليها في حالة تعليق تميل إلى التجمع مع بعضها البعض، مما يؤدي إلى تباين أكبر في الحجم؛ ولتجاوز ذلك، تم استزراع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (H PSCs) في آبار منخفضة الالتصاق، مما أدى إلى عدم تكوين أجسام جنينية وموت الخلايا. ومع ذلك، فإن الجمع بين جزيء بقاء الخلية Y 2 7 6 3 2 وكحول البولي فينيل (polyvinyl alcohol)، الذي ثبت أنه يعزز تكوين الأجسام الجنينية من الخلايا الجذعية البشرية (HSCs)، سمح بتكوين الأجسام الجنينية من معلقات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) أحادية الخلية خلال الليل.

من الناحية العملية، يمكن التحكم بدقة في أحجام الأجسام embryoid (EBs) في تنسيق لوحة العيارات المتعددة هذه من خلال وضع أعداد مختلفة من الخلايا في كل بئر. وبخلاف استخدام التقنيات التقليدية، بعد نقل الأجسام embryoid إلى أطباق 96 U ذات الالتصاق المنخفض للغاية، تم تحفيز تكوين الأديم الظاهر العصبي باستخدام مزيج من الجزيئات الصغيرة يتكون من مثبطات F-G-F-E-R-K-T-G، وTGF beta SMA two، وBP SMA one، مما سمح بعد ذلك بزراعة الخلايا على matrigel لإنتاج الخلايا العصبية. وقد حقق بدء تكوين الأجسام embryoid من حوالي 8,000 خلية أفضل قدرة على التمايز العصبي، والتي تتميز بنمو عصبي واضح من الأجسام embryoid المزروعة.

انخفاض مراكز الأجسام المضغوطة (EB) النخرية بعد الزراعة، مع تعبير عالٍ للمؤشرات الحسية والمؤشرات العصبونية الشاملة مثل B rrn three A وbeta three tubulin. وتبدو كفاءات التمايز العصبوني الإجمالية قابلة للمقارنة مع الإجراء الأصلي، والذي كان قابلاً للتطبيق على كل من HSCs وHI PSCs حتى الآن. وقد تم اختبار ثلاثة خطوط مستقلة من HPSC، بما في ذلك خلايا HES وHIPS بنجاح في إجراء تعدد الآبار، بينما لا يمكن بشكل عام استبعاد التباين وكفاءات التمايز المعتمدة على الخط الخلوي.

يوضح هذا الشكل خلايا أديم عصبي مفردة مفككة من اليوم الرابع، تم توزيعها كخلايا مفردة وتمايزت بنجاح بكفاءة تقارب 60%. يتطلب التعامل مع EBS في منصة التوزيع المتعدد (multi titter platform) بعض التدريب في البداية، ولكن بعد فترة من الوقت، ستلاحظ أنها سهلة للغاية.